Restorasi Karang di Era Omics: Pengembangan Alat Point-of-Care untuk Memantau Penyakit, Reproduksi, dan Stres Termal

ABSTRAK
Degradasi terumbu karang telah menarik perhatian global dari pemerintah, konservasionis, dan peneliti, yang melakukan upaya bersama untuk mengembangkan solusi berkelanjutan untuk mendukung ketahanan terumbu karang dalam menghadapi degradasi lingkungan. Tujuannya adalah untuk memberdayakan upaya masyarakat setempat untuk pengelolaan sumber daya laut yang efektif. Namun, salah satu hambatan utama untuk konservasi karang adalah kurangnya data kesehatan tingkat populasi yang tepat waktu dan terjangkau, yang dapat menunda respons pengelolaan yang efektif. Meskipun kemajuan telah dibuat dalam memahami dasar molekuler dari hasil kesehatan karang, lebih banyak pekerjaan translasi diperlukan untuk mengembangkan alat diagnostik point-of-care (POC) yang hemat biaya untuk pemantauan waktu nyata. Tinjauan ini menilai status terkini penelitian berbasis omik translasi untuk pemantauan kesehatan karang, dengan fokus pada penyorotan kesenjangan utama dan langkah selanjutnya yang dapat ditindaklanjuti untuk memandu penerapan alat yang efektif dan siap pakai di lapangan untuk memantau penyakit karang, reproduksi, dan stres termal. Kemajuan ini dapat digunakan untuk memajukan kebutuhan konservasi yang mendesak dan mempromosikan pengelolaan terumbu karang oleh masyarakat setempat.

Singkatan
Bahasa Inggris CBS
sistem stres otomatis pemutihan karang
Bahasa Indonesia: CMSA
pemijahan massal karang secara asinkron
DART-MS
analisis langsung dalam spektrometri massa waktu nyata
POC
titik perawatan
1 Pendahuluan
Penurunan terumbu karang yang semakin cepat secara global telah memacu pertumbuhan pesat program restorasi karang [ 1 ]. Sebagian besar upaya ini berupaya untuk mengurangi hilangnya kumpulan karang dengan mengumpulkan gamet atau fragmen dari koloni karang liar pembentuk terumbu, menumbuhkannya di sistem pembibitan in situ dan/atau ex situ, dan kemudian menanamnya kembali ke lokasi yang terdegradasi. Selama empat dekade terakhir, proyek restorasi terumbu telah berevolusi dari studi percontohan yang difokuskan pada pengujian kelayakan, mengevaluasi metode, dan menilai kelangsungan hidup karang menjadi upaya restorasi dan intervensi multi-tahun di wilayah yang luas [ 2 ]. Konservasi karang terus berkembang dalam ukuran, cakupan, dan jangkauan geografis karena peran integralnya dalam pengelolaan terumbu semakin diakui [ 3 ]. Namun, pekerjaan komunitas restorasi karang dan kesehatan terumbu tetap rentan terhadap perubahan iklim global [ 4 ]. Selain itu, terumbu karang sebagian besar ada di negara-negara bangsa yang secara tidak proporsional terkena dampak degradasi lingkungan. Negara-negara ini berkontribusi paling sedikit terhadap emisi global namun paling berisiko secara finansial dan budaya dan memiliki sumber daya paling sedikit yang tersedia untuk melestarikan ekosistem lokal [ 5 ]. Dengan demikian, ada kebutuhan yang semakin meningkat untuk solusi pemantauan karang yang: (1) berbiaya rendah, (2) dapat digunakan dengan mudah, dan (3) dengan cepat memberikan wawasan yang dapat ditindaklanjuti tentang bagaimana karang yang dipulihkan dan liar merespons pemanasan lautan, mekarnya alga yang berbahaya, kekeruhan, polusi air, dan penyakit yang muncul [ 6 ]. Alat-alat tersebut akan memungkinkan praktisi restorasi karang untuk membuat keputusan yang lebih terinformasi dan proaktif tentang teknik dan logistik di sekitar program restorasi spesifik mereka selama ancaman episodik terhadap karang. Di sini, kami meninjau secara singkat status pemantauan kesehatan karang saat ini menggunakan metode multi-omik mutakhir. Wawasan ini mengarahkan kami untuk menyarankan kerangka kerja adaptif untuk implementasi toolkit yang dapat digunakan untuk memantau kesehatan dan reproduksi karang dan diulang melalui penerapan dan penjangkauan (Gambar 1 ).

 

Adapun populasi manusia, hasil kesehatan untuk kumpulan karang bergantung pada interaksi antara variasi genetik yang ada dan bagaimana ini berinteraksi dengan faktor risiko lingkungan dan lainnya. Risiko lingkungan (misalnya, stres termal, eutrofikasi, penangkapan ikan herbivora yang berlebihan, polusi, dan penyakit) menjadi perhatian utama bagi praktisi restorasi [ 7 ]. Kumpulan karang ada di sepanjang spektrum risiko lingkungan. Sementara beberapa terumbu tumbuh subur di perairan yang relatif murni, seperti yang ada di Segitiga Terumbu Karang yang memiliki keanekaragaman hayati [ 8 ], banyak lainnya, seperti yang ada di Karibia, menghadapi stres berkelanjutan dari pengelolaan terumbu air yang menghangat, penyakit, dan tekanan lingkungan lokal [ 9 ]. Kebutuhan pemantauan mungkin berbeda untuk kumpulan terumbu di kedua ujung spektrum, dengan terumbu yang sehat terutama ditargetkan untuk observasi jangka panjang (misalnya, “pemeriksaan”) dan wilayah yang lebih terganggu ditargetkan untuk penilaian risiko/dampak.

Kolaborasi global dan minat yang tumbuh dalam konservasi karang telah memajukan pemantauan kesehatan karang melampaui survei visual skala kecil menuju penyaringan area terumbu karang yang cepat dan efektif [ 10 – 12 ]. Survei udara dan submersible skala besar dan sistem portabel untuk menguji ketahanan karang pada skala regional [ 13 ] semakin banyak diadopsi untuk pemantauan karang. Coral Bleaching Automated Stress System (CBASS) adalah contoh platform berbiaya rendah dan portabel yang telah diadopsi secara luas untuk diagnostik kesehatan karang. CBASS adalah sistem eksperimental yang, menggunakan profil stres suhu standar, dengan cepat menilai ambang batas termal menggunakan metrik pemutihan standar seperti kandungan klorofil- a , kepadatan sel simbion, dan efisiensi fotosintesis ( F v / F m ) [ 14 ]. Metode seperti color score [ 15 ], Community In situ Metabolism device (CISME Instruments, LLC) [ 16 ], grafting-based genotypic diversity assay [ 17 ], dan Fluorescence Imaging System (FluorIS) untuk deteksi rekrutmen [ 18 ] menyediakan contoh lain dari sistem portabel berbiaya rendah, hambatan rendah untuk menguji metrik tingkat populasi atau komunitas yang terkait dengan kesehatan karang. Meskipun metode ini efektif untuk pemantauan terumbu, data tambahan tentang kesehatan dan ketahanan karang, seperti yang dijelaskan di bawah ini untuk penyakit karang, pemijahan massal, dan stres termal, dapat menambah wawasan penting yang dapat ditindaklanjuti bagi pengelola terumbu. Dengan menggunakan data multiomik terintegrasi termasuk transkriptomik, proteomik, dan metabolomik, uji point-of-care (POC) cepat dapat dikembangkan menggunakan biomarker (lihat Kotak ) kesehatan karang dan kapasitas adaptif. Di sini, kami menyoroti bidang-bidang utama pemantauan karang dan bagaimana bidang-bidang tersebut dapat ditingkatkan menggunakan teknologi diagnostik molekuler yang dikembangkan untuk pemantauan kesehatan dan penyakit manusia, yang dapat dengan mudah diterapkan untuk konservasi karang. Di bawah ini, kami membahas strategi untuk mencapai tujuan ini, tetapi pertama-tama kami akan memberikan pengantar singkat tentang biologi karang.

1.1 Holobiont Karang
Kemitraan antara inang cnidaria dan endosimbion dinoflagellata (alga) bersel tunggal dalam famili Symbiodiniaceae “memberdayakan” ekosistem terumbu karang tropis melalui penyediaan fotosintat dan nutrisi lainnya [ 19 ]. Namun, di bawah tekanan termal, pertukaran nutrisi antara inang karang dan endosimbion terganggu, yang dapat menyebabkan pengusiran alga dari jaringan karang (yaitu, “pemutihan”) [ 20 ]. Dalam keadaan ini, inang karang rentan terhadap ancaman seperti penyakit atau pemangsaan [ 21 ], dan dapat mati jika simbiosis tidak dibangun kembali [ 22 ]. Di luar tekanan termal, dampak lingkungan lainnya, termasuk sedimentasi, eutrofikasi, dan penangkapan ikan herbivora yang berlebihan juga berdampak pada kesehatan karang [ 6 ]. Karena gelombang panas laut adalah salah satu penyebab utama kematian karang global [ 23 ], penemuan biomarker untuk membantu upaya pemantauan karang terutama difokuskan pada pengembangan perpustakaan penanda asam nukleat yang menunjukkan stres, adaptasi, atau aklimatisasi terhadap suhu yang lebih hangat [ 24 ]. Namun, banyak dari biomarker putatif ini belum dinilai kemampuannya untuk mendiagnosis stresor lain, atau gabungan. Selain itu, tantangan reproduksi, seperti asinkroni pemijahan massal, yang membatasi pemulihan populasi setelah peristiwa kematian massal [ 25 ] (dibahas di bawah Bagian 3.2 ) dan wabah penyakit [ 26 ] (dibahas di bawah Bagian 3.1 ) menimbulkan tantangan signifikan bagi upaya restorasi karang. Pekerjaan tambahan diperlukan untuk mengidentifikasi, memvalidasi, dan mengintegrasikan biomarker yang mencakup berbagai tantangan kesehatan yang sering terjadi bersamaan yang dihadapi karang ke dalam alat siap lapangan yang dapat meningkatkan pemantauan kesehatan karang.

Kesehatan karang dan kapasitas adaptif tidak hanya bergantung pada inang dan alga simbiotiknya (Symbiodiniaceae) tetapi juga pada asosiasi kompleks mikroorganisme yang membentuk holobiont karang (lihat Kotak ), termasuk protista, jamur, virus, dan prokariota [ 27 ]. Kisaran respons terhadap stres sangat bervariasi baik di dalam maupun di antara populasi dan spesies karang karena perbedaan dalam sejarah alam, asal geografis, komposisi simbion alga, komposisi mikrobioma, tahap perkembangan, dan genotipe [ 28 – 31 ]. Contoh utama dari hal ini adalah strategi transmisi. Meskipun sebagian besar spesies karang pemijahan siaran memperoleh simbion setiap generasi melalui transmisi horizontal dari lingkungan lokal, hanya sekitar 25% dari pemijahan siaran yang mewarisi simbion mereka secara vertikal [ 32 , 33 ]. Kekuatan selektif yang mendorong masing-masing strategi ini kemungkinan mencerminkan tekanan lingkungan baik untuk beraklimatisasi cepat terhadap kondisi variabel dengan memperoleh garis keturunan alga yang beradaptasi secara lokal setiap generasi (melalui transmisi horizontal), atau untuk mempertahankan hubungan jangka panjang dengan simbion di habitat yang lebih stabil (melalui transmisi vertikal) [ 34 ]. Karena keragaman kekuatan selektif dan interaksi biotik yang berkontribusi pada biologi holobiont karang, memahami pendorong variasi dalam ketahanan stres karang dan dasar genomik untuk kapasitas adaptif tetap menjadi tantangan. Meskipun ada keterbatasan ini, metode multi-omik telah mengidentifikasi beberapa penanda stres dan adaptasi putatif dalam holobiont karang yang belum divalidasi dan diintegrasikan ke dalam alat yang dapat digunakan di lapangan [ 24 ]. Di bawah ini, kami menjelaskan status terkini alat diagnostik berbasis biomarker molekuler untuk pemantauan kesehatan karang, dengan fokus pada metabolomik dan proteomik, yang kurang dipelajari dengan baik daripada respons transkriptomik. Kami juga memberikan gambaran umum tentang aplikasi yang relevan untuk pendekatan berbasis biomarker, menyoroti alat yang ada dan yang baru muncul yang dapat dimasukkan ke dalam perangkat pemantauan kesehatan karang.

Kotak

2 Pengembangan Alat Berbasis Biomarker untuk Pemantauan Kesehatan Karang
2.1 Kondisi Diagnostik Berbasis Biomarker Saat Ini untuk Pemantauan Kesehatan Karang
Diagnostik kesehatan karang yang dimungkinkan oleh biomarker masih dalam tahap awal. Meskipun ada minat baru-baru ini dalam uji POC untuk membantu upaya pemulihan karang, pengembangan alat sebagian besar terhenti pada fase penemuan biomarker, terutama karena kurangnya infrastruktur, serta kendala logistik dan keuangan [ 24 ]. Banyak biomarker, khususnya RNA, metabolit, dan protein, sangat labil pada suhu kamar, memerlukan pengawetan pada suhu -80°C untuk menjaga integritas sampel. Namun, metode pengawetan standar, seperti nitrogen cair, es kering, dan freezer ultra-rendah mahal dan sering kali tidak tersedia di lokasi lapangan terpencil. Kemajuan terbaru dalam pengawetan biomolekul telah menyebabkan ketersediaan komersial produk stabilisasi suhu kamar, termasuk DNA/RNA Shield (Zymo Research), RNAlater (ThermoFisher Scientific), dan OMNImet·GUT (DNA Genotek). Reagen ini memungkinkan pengawetan asam nukleat, protein, dan metabolit, masing-masing, untuk periode terbatas pada suhu kamar dan penyimpanan yang diperpanjang pada −20°C, memungkinkan pengumpulan dan pengiriman sampel yang aman dari terumbu karang di wilayah dengan penyimpanan rantai dingin yang terbatas. Di luar pengawetan sampel, hambatan finansial dan logistik tetap menjadi tantangan signifikan untuk penelitian biomarker. Peralatan laboratorium dan sumber daya yang dibutuhkan untuk analisis molekuler, seperti spektrometri massa dan sekuensing throughput tinggi, sering kali tidak tersedia atau mahal di banyak wilayah tropis tempat terumbu karang berada. Akibatnya, kolaborasi global, jaringan berbagi pengetahuan, dan kemitraan dengan lembaga yang didanai dengan baik sangat penting untuk memajukan validasi dan implementasi biomarker. Selain itu, pendanaan untuk penelitian di luar penemuan biomarker terbatas pada negara-negara “WEIRD” (Barat, Terdidik, Terindustrialisasi, Kaya, dan Demokratis), sangat kompetitif, dan sering kali membutuhkan kolaborasi bisnis. Memperluas peluang pendanaan melalui kemitraan interdisipliner, kolaborasi publik-swasta, dan inisiatif teknologi konservasi akan sangat penting untuk menjembatani kesenjangan ini dan menerjemahkan penelitian biomarker menjadi alat siap pakai di lapangan.

Karena perkembangan pesat dalam teknologi sequencing generasi berikutnya, pengembangan biomarker terutama difokuskan pada penemuan biomarker genomik dan transkriptomik untuk kesehatan dan ketahanan karang [ 35 ]. Biomarker asam nukleat terutama diukur menggunakan uji berbasis PCR, yang memerlukan peralatan berat dan mahal serta pengaturan lab yang steril. Dengan demikian, teknik yang ampuh ini belum diterapkan secara luas untuk pemantauan kesehatan karang di lapangan. Namun, ini dapat berubah dengan pendekatan lain, seperti perangkat mikrofluida berbasis nanoball yang baru-baru ini dikembangkan untuk mendeteksi produk amplifikasi isotermal yang dimediasi loop (LAMP) [ 36 ], yang dapat memungkinkan kuantifikasi biomarker DNA dan RNA yang sensitif dan otomatis. Pendekatan ini akan memungkinkan pengembangan alat yang dapat digunakan di lapangan secara cepat untuk mendeteksi biomarker transkrip atau patogen (DNA).

Penerapan teknik spektrometri massa berthroughput tinggi baru-baru ini dalam pengaturan klinis membuka jalan bagi pengujian berbasis data metabolomik dan proteomik dalam penelitian kelautan [ 37 ]. Dalam hal teknologi diagnostik, pengujian untuk pengukuran biomarker metabolit dan protein yang cepat dan murah dari jalur metabolisme sentral telah maju lebih cepat daripada pengujian untuk mendeteksi asam nukleat karena implementasi (dan validasi) skala besar dalam pengaturan klinis. Platform POC manusia yang ada menggunakan biomarker metabolit dan protein, seperti pengujian aliran lateral berbasis antibodi (misalnya, kit deteksi kehamilan dan COVID-19) dan pengujian kimia kolorimetri (misalnya, dipstick urinalisis manusia [lihat di bawah] dan meteran glukosa diabetes), adalah “buah yang mudah dipetik” yang dapat diadaptasi untuk pemantauan kesehatan karang. Namun, penelitian tambahan diperlukan untuk menyusun perpustakaan biomarker protein atau metabolit kesehatan karang yang tervalidasi yang akan siap untuk diintegrasikan ke dalam platform pengujian POC yang ada.

2.2 Pertimbangan untuk Penemuan dan Validasi Biomarker
Bahasa Indonesia: Untuk secara efektif mengadaptasi uji POC manusia yang ada untuk pemantauan kesehatan karang, variasi dalam dan di antara holobiont karang harus dipertimbangkan. Menemukan penanda yang dilestarikan di seluruh Scleractinia kemungkinan akan menjadi tantangan karena divergensi evolusi yang besar dalam garis keturunan ini; perkiraan waktu perpecahan karang batu adalah ∼240 juta tahun [ 38 , 39 ], dibandingkan dengan garis keturunan manusia, yang menyimpang dari Monyet Dunia Baru ∼30–35 juta tahun yang lalu [ 40 ]. Untuk memperhitungkan keragaman ini, penemuan biomarker harus fokus pada pengembangan (1) serangkaian penanda metabolik atau protein inti yang divalidasi yang dilestarikan di seluruh Scleractinia atau Metazoa, dan (2) berbagai set biomarker yang menargetkan populasi tertentu dengan biologi dan faktor risiko bersama (misalnya, Acropora cervicornis dan Acropora palmata di wilayah Karibia).

Validasi untuk biomarker yang dilestarikan di seluruh Scleractinia harus mencakup pengujian untuk kebutuhan tingkat spesies dan populasi untuk sensitivitas biomarker. Misalnya, Seveso et al. [ 41 ] menunjukkan perbedaan dalam modulasi Protein Syok Panas 60 (HSP60) di bawah pemutihan pada spesies yang berbeda. Meskipun semua spesies menunjukkan peningkatan awal dalam kadar HSP60 diikuti oleh penurunan yang berkorelasi dengan sensitivitas pemutihan, besarnya dan waktu respons ini bervariasi antara spesies. Meskipun HSP60 dapat berfungsi sebagai penanda potensial untuk ketahanan stres, ia berfungsi sebagai contoh utama dari kebutuhan untuk menggambarkan batas deteksi dan sensitivitas perangkat POC untuk memastikan diagnostik yang andal di seluruh spesies target. Validasi respons biomarker yang dilestarikan di seluruh spesies akan sangat menonjol untuk pengembangan biomarker reproduksi karena keragaman strategi reproduksi yang luas (misalnya, dioecious, monoecious, sex switching, pseudo-gynodioecious) dalam garis keturunan karang [ 33 ]. Oleh karena itu, validasi penanda inti kemungkinan akan tetap menjadi rintangan utama dalam pengembangan alat POC yang berlaku secara luas.

Standardisasi juga tetap menjadi rintangan utama untuk merancang biomarker yang menargetkan populasi tertentu, karena biomarker yang efektif dalam satu populasi karang atau wilayah geografis mungkin tidak berlaku secara universal di seluruh spesies. Pertama, eksperimen harus mempertimbangkan struktur genetik populasi. Fragmen karang yang digunakan dalam eksperimen harus mencerminkan keragaman genetik populasi target untuk memperhitungkan variasi yang didorong oleh genotipe dalam endofenotipe (misalnya, ekspresi gen, metabolom, proteom), yang seringkali dapat lebih kuat daripada variasi yang didorong oleh stres pada karang dan organisme lain [ 42 – 44 ]. Pertimbangan lain adalah bahwa karang mengalami banyak stresor yang sering terjadi bersamaan, yang mengharuskan biomarker divalidasi untuk spesifisitasnya dalam mendiagnosis atau memprediksi kondisi target.

Dalam hal penemuan biomarker, biomarker karang saat ini terutama menargetkan biologi inang, dengan sedikit yang membahas anggota alga dan prokariotik holobiont. Simbion memiliki gaya hidup fakultatif, di mana mereka hidup baik sebagai sel yang hidup bebas maupun di dalam inang karang [ 45 ] dan telah mempertahankan “gaya hidup ganda” ini selama >200 juta tahun sejak karang ada [ 32 , 46 ]. Repertoar gen Symbiodiniaceae yang besar (>30K) [ 47 ], memperjelas bahwa interaksi holobiont terdiri dari model studi yang kompleks di bawah kondisi lingkungan yang stabil dan penuh tekanan dan merupakan kunci untuk memahami dan memprediksi respons karang terhadap stres. Oleh karena itu, upaya konservasi juga harus membahas biologi dan biokimia simbion, baik dalam hospite maupun ex hospite (lihat Kotak ).

Mengikuti model pengembangan uji POC pada manusia, studi lapangan skala besar yang menggabungkan berbagai faktor risiko lingkungan dan kumpulan spesies yang beragam secara taksonomi diperlukan untuk memvalidasi biomarker diagnostik. Demikian pula, studi longitudinal jangka panjang yang juga memperhitungkan keragaman taksonomi dan lingkungan diperlukan untuk memvalidasi biomarker prediktif kapasitas adaptif dan ketahanan. Singkatnya, saat kita memajukan penemuan dan validasi biomarker kesehatan karang, desain eksperimental harus menggabungkan keragaman seluruh holobiont untuk mengembangkan alat universal yang efektif dan dapat diterapkan di lapangan yang dapat diterapkan di seluruh sistem dan spesies.

3 Aplikasi Alat Berbasis Biomarker
Di bawah ini, kami merangkum tiga aplikasi utama untuk alat pemantauan karang berbasis biomarker dan status terkini pengembangan alat yang terkait dengan masing-masing alat. Kami fokus pada biomarker metabolit dan protein karena, seperti yang dibahas di atas, kerangka kerja untuk mengintegrasikan biomarker ini ke dalam platform pengujian sudah ada untuk diagnostik manusia dan merupakan “hasil yang mudah dicapai” untuk pemantauan kesehatan karang.

3.1 Diagnostik Penyakit Karang
Penyakit karang merupakan salah satu penyebab utama kematian karang global [ 7 ]. Oleh karena itu, ada kebutuhan yang semakin meningkat untuk memantau penyebarannya di populasi liar [ 48 ] dan mengidentifikasi pembawa asimtomatik untuk mencegah penularan di pembibitan karang [ 49 ]. Namun, diagnosis penyakit karang secara historis telah menjadi tantangan karena kurangnya alat yang dapat diandalkan untuk mengidentifikasi agen penyebab penyakit yang berdampak pada karang (misalnya, penyakit kehilangan jaringan karang berbatu [SCTLD]) [ 48 ], dan diferensiasi molekuler antara patologi yang serupa. Sampai saat ini, penyakit sebagian besar telah diidentifikasi berdasarkan warna dan pola area yang terkena (misalnya, Putih, Kuning, Hitam) [ 50 , 51 ]. Saat ini tidak diketahui apakah berbagai presentasi fenotipik setiap penyakit berasal dari agen penyebab yang sama atau berbeda. Pendekatan DNA yang sering berhasil pada organisme non-model lainnya [ 52 ] sekarang digabungkan dengan bukti fenotipik penyakit untuk menentukan agen penyebab [ 48 ]. Namun, diagnosis penyakit berbasis DNA menghadirkan tantangan unik pada karang. Pertama, membuang jaringan yang sakit untuk analisis dapat membahayakan koloni di lokasi lesi penyakit. Kedua, karena sampel jaringan karang juga mengandung dinoflagellata simbiotik, bakteri, dan virus, pendekatan DNA harus dirancang untuk memperhitungkan semua komponen dan permutasi holobiont untuk menentukan apakah ada agen penyebab penyakit. Ini rumit, terutama mengingat beberapa penyakit tampaknya melibatkan konsorsium konsisten prokariota yang tidak patogen [ 53 – 55 ]. Komponen mikroba ini mencerminkan lokasi, musim, dan jenis karang (yaitu, karang memiliki mitra simbion yang unik dan menunjukkan fluktuasi musiman) [ 27 ]. Karena heterogenitas sampel, terus menjadi sangat sulit untuk mengembangkan platform diagnostik yang andal. Oleh karena itu, apa pun kecuali presentasi penyakit kanonik sulit, jika tidak mustahil, untuk didiagnosis menggunakan fenotipe visual standar dan pendekatan DNA [ 56 ]. Kemajuan di bidang ini akan sangat dibantu oleh pengembangan metode yang lebih akurat untuk klasifikasi penyakit.

Spektroskopi massa, pekerja keras untuk metabolomik, menyediakan alat yang berguna untuk menganalisis sejumlah besar data untuk mengidentifikasi biomarker metabolik dan telah berhasil digunakan dalam biomedis untuk menentukan status penyakit, termasuk penyakit Alzheimer, demensia, penyakit Parkinson, dan penyakit kardiovaskular [ 57 ]. Dengan keberhasilan ini, serta penurunan biaya dan perbaikan teknologi, metabolomik sekarang diterapkan untuk deteksi penyakit pada model karang [ 48 , 58 , 59 ]. Analisis langsung dalam spektrometri massa waktu nyata (DART-MS), metode baru untuk metabolomik yang memungkinkan sidik jari metabolit cepat dari sampel heterogen (misalnya, jaringan tanaman, organisme hidup, cairan) di lingkungan terbuka [ 60 ], menyediakan pendekatan yang menjanjikan untuk penemuan biomarker metabolik di karang. Platform DART-MS juga cepat, memiliki persyaratan persiapan sampel minimal, dan hemat biaya setelah akuisisi peralatan awal. Pendekatan ini telah diterapkan pada karang untuk membedakan genera menggunakan tanda kimia unik mereka dan, dengan optimasi, memiliki potensi untuk membedakan sampel karang berdasarkan spesies, identitas klon, dan status pemutihan [ 61 ]. Dalam hal diagnosis penyakit karang, pendekatan berbasis DART-MS akan memfasilitasi penemuan biomarker metabolit, membedakan status penyakit (misalnya, penyakit pita hitam, penyakit pita kuning, penyakit kehilangan jaringan karang berbatu) dengan sindrom metabolik daripada patogen (misalnya, Gambar 2 ). Misalnya, sebuah studi baru-baru ini menunjukkan bahwa status penyakit karang dapat dinilai secara tidak mencolok dengan mengambil sampel lendir karang menggunakan profil asam lemak untuk secara efektif membedakan karang yang sehat dari yang sakit [ 62 ]. Dalam kasus penyakit yang melibatkan konsorsium mikroba, ini dapat memberikan metode yang lebih andal untuk diagnosis penyakit daripada pendekatan fenotipe visual dan DNA. Setelah identifikasi biomarker, validasi diagnostik dapat dilanjutkan pada platform DART-MS dan dialihkan ke uji strip uji kolorimetri untuk deteksi penyakit yang dapat digunakan di lapangan.

3.2 Pemantauan Pemijahan Karang
Populasi karang harus mampu bereproduksi untuk pulih dari gangguan dan mempertahankan diri mereka sendiri dari waktu ke waktu. Dalam beberapa tahun terakhir, para peneliti, praktisi, dan manajer telah mengakui pentingnya stok karang yang berasal dari seksual dalam memperluas keragaman genetik dan skala spasial upaya pemulihan terumbu karang [ 6 , 63 , 64 ]. Namun, karang dari spesies yang sama dalam suatu sistem terumbu karang dapat memijah pada malam yang berbeda atau pada waktu yang berbeda di malam hari [ 65 – 67 ], mencegah mereka berkembang biak satu sama lain karena degradasi gamet dan/atau penyebaran. Pemijahan sinkron sangat penting untuk mencapai pembuahan [ 68 , 69 ]. Bukti semakin banyak bahwa di seluruh dunia, karang memijah dengan asinkroni yang semakin meningkat, atau tidak sama sekali [ 70 – 73 ], mungkin karena perubahan antropogenik seperti pemanasan laut dan polusi cahaya mengganggu kemampuan mereka untuk mendeteksi isyarat lingkungan dengan andal. Fenomena ini dikenal sebagai asinkroni pemijahan massa karang (CMSA ; lihat Kotak) . CMSA dapat menyebabkan banyak masalah hilir, seperti gamet yang tidak dapat hidup, keberhasilan pembuahan yang rendah, dan pencampuran genotipe yang rendah, yang semuanya mengurangi kemampuan populasi untuk pulih setelah gangguan dan merusak upaya konservasi dan pemulihan yang sedang berlangsung. Terutama untuk spesies yang terancam punah, yang jumlahnya sedikit membuat mereka sudah rentan terhadap “efek Allee”, yang menyatakan bahwa ukuran populasi yang rendah dapat berdampak negatif pada kebugaran individu, dan dengan demikian, tingkat reproduksi [ 74 ]. Oleh karena itu, pengembangan alat untuk menilai status reproduksi merupakan prioritas tinggi untuk memantau populasi liar dan untuk membantu program pemuliaan.

Pendekatan terkini untuk mempelajari siklus reproduksi karang biasanya melibatkan pengambilan sampel untuk histologi, yang memerlukan waktu berminggu-minggu hingga berbulan-bulan untuk menghasilkan hasil, dan cabang-cabang yang “retak” untuk menilai secara visual keberadaan berkas gamet, yang bersifat invasif dan tidak cocok untuk spesies karang masif (yaitu, gundukan) atau gonokor (koloni jantan dan betina terpisah). Untuk spesies yang biologi reproduksinya kurang diketahui, penanda metabolit dan hormon steroid merupakan jalan yang menjanjikan untuk pemantauan dan intervensi reproduksi. Konsentrasi hormon seks yang tinggi telah dideskripsikan dalam karang selama periode pemijahan tahunan [ 75 ], dengan demikian mendukung gagasan bahwa karang dapat secara endogen mensintesis hormon seks jenis vertebrata [ 76 ]. Selain itu, dengan menggunakan data awal, Williams et al. [ 77 ] menunjukkan bahwa stres termal menekan kadar hormon seks karang yang diprediksi (validasi metabolit ini, bagaimanapun, masih diperlukan) jika dibandingkan dengan kondisi sekitar, yang menunjukkan bahwa CSMA dapat dideteksi menggunakan biomarker hormon. Langkah selanjutnya untuk penemuan biomarker hormon steroid harus mencakup karakterisasi siklus hormon steroid karang tahunan di bawah kondisi lingkungan dan stres di berbagai spesies dengan strategi reproduksi yang berbeda. Validasi biomarker kemudian harus dilakukan di bawah kondisi laboratorium yang terkendali dan studi lapangan skala besar dengan populasi liar. Akhirnya, biomarker yang tervalidasi dapat diintegrasikan ke dalam prototipe alat diagnostik, yang mungkin memerlukan kemitraan industri swasta, dan harus diuji menggunakan sampel yang sama untuk memastikan presisi dan akurasi pengujian. Di masa mendatang, penemuan metabolit dan penanda hormon steroid dapat memungkinkan penerapan uji POC untuk diagnostik manusia, seperti kehamilan dan pembuahan, untuk memfasilitasi pemantauan dan pengelolaan reproduksi. Pemahaman terperinci tentang pola siklus hormon seks di berbagai spesies yang beragam secara taksonomi yang mewakili luasnya strategi reproduksi yang digunakan oleh karang berpotensi mengarah pada strategi untuk manipulasi reproduksi karang menggunakan terapi hormon, meningkatkan kapasitas dan efisiensi berbagai intervensi reproduksi genetik dan reproduksi berbantuan.

3.3 Diagnosis dan Prediksi Stres Termal
Sampai saat ini, sebagian besar pekerjaan yang melibatkan biomarker karang telah dilakukan dalam konteks stres termal, dengan fokus khusus pada tanda-tanda transkriptomik [ 78 ]. Namun, selain CBASS [ 78 ], penelitian ini belum diterjemahkan secara luas ke dalam alat yang dapat digunakan di lapangan untuk pemantauan stres termal. Banyak alat yang dapat digunakan di lapangan yang saat ini digunakan oleh praktisi restorasi memerlukan penilaian pemutihan yang terlihat untuk diagnosis stres termal [ 15 , 79 – 81 ]. Namun, alat molekuler mungkin dapat mendiagnosis stres pada karang sebelum dimulainya pemutihan, yang memungkinkan pemantauan ambang pemutihan pada populasi liar dan penyebaran cepat tindakan intervensi untuk pembibitan karang [ 82 ]. Selain itu, RNA mungkin bukan penanda ideal kondisi kesehatan karang karena waktu paruhnya yang pendek dan variasi kelimpahan yang tinggi di antara spesies yang berbeda dan dalam populasi (untuk detailnya, lihat Chille et al., [ 44 ]). Di bawah ini, kami menjelaskan dua alat berbasis biomarker yang muncul untuk pemantauan stres termal pada karang: strip uji urinalisis dan uji aliran lateral.

Strip urinalisis (Accutest URS 10; sekitar $15-25 untuk 100 strip) digunakan untuk mendeteksi biomarker metabolit pada manusia yang bersifat diagnostik terhadap sindrom metabolik (misalnya, diabetes, fungsi ginjal, infeksi saluran kemih) [ 83 ]. Penelitian terkini telah menunjukkan bahwa alat ini dapat digunakan dalam karang untuk mendeteksi stres termal (Gambar 3A ) menggunakan protokol ekstraksi metabolit sederhana yang dikembangkan untuk tonjolan karang yang berpotensi juga dapat diterapkan pada lendir karang [ 84 ]. Strip uji urinalisis untuk mendeteksi stres termal divalidasi pada tingkat populasi dalam koloni liar Porites compressa yang dikumpulkan dari enam terumbu di Teluk Kāneʻohe, Oʻahu, Hawaiʻi (Gambar 3D ), serta dalam sistem eksperimen terkontrol dengan spesies yang secara taksonomi berkerabat jauh, termasuk Montipora capitata , Pocillopora acuta , dan Porites compressa (Gambar 3B,C ). Dari 10 uji diagnostik yang terwakili pada strip ini, dua tampaknya paling berlaku untuk karang: uji keton, yang mengukur asetoasetat (biomarker kekurangan glukosa, meningkat di bawah kondisi stres), dan uji leukosit, yang mengukur aktivitas esterase (biomarker respons imun, meningkat di bawah stres). Tingkat biomarker ini bervariasi antar spesies berdasarkan genotipe dan ketahanan termalnya. Hasil strip uji dari M. capitata dibandingkan dengan data transkriptomik yang dihasilkan dari sampel yang sama, yang memberikan bukti yang mendukung sindrom stres yang dideteksi oleh strip [ 84 ]. Untuk membuat uji strip uji lebih dapat digunakan di lapangan, dudukan telepon pintar cetak 3D dirancang dan dipasangkan dengan perangkat lunak pemrosesan gambar untuk analisis strip uji skala besar yang cepat ( TestStripDX ) (Gambar 3A ). Pendekatan ini memberikan contoh bagaimana uji POC manusia yang ada dapat dengan mudah diadaptasi, dengan penyesuaian sensitivitas dan jangkauan serta batasan deteksi, untuk pemantauan kesehatan karang pada tingkat populasi. TestStripDX berfungsi sebagai model untuk mengembangkan uji dipstick kolorimetri tambahan untuk diagnosis dan prediksi stres termal. Langkah selanjutnya yang memanfaatkan pendekatan ini harus mencakup studi percontohan untuk memvalidasi kemanjuran uji ini untuk mendiagnosis stres di seluruh spesies karang dan wilayah geografis, menguji uji kolorimetri berbasis manusia lainnya untuk diagnosis atau prediksi stres termal, dan penemuan serta validasi biomarker metabolik khusus karang yang dapat diintegrasikan ke dalam uji kolorimetri yang ada.

Pendekatan lain yang menjanjikan untuk memantau kesehatan karang di lapangan adalah penggunaan alat berbasis antibodi, seperti uji aliran lateral. Meskipun penelitian metaproteomik pada karang relatif baru, dengan hanya beberapa studi yang mengeksplorasi sumber data omik yang kaya ini [ 85 – 87 ], beberapa biomarker berbasis protein menunjukkan janji untuk diintegrasikan ke dalam alat yang hemat biaya dan dapat digunakan di lapangan ini untuk pemantauan stres termal. Contoh protein karang yang menunjukkan janji untuk diintegrasikan ke dalam uji aliran lateral atau alat berbasis antibodi lainnya termasuk apolipophorin (Gambar 4 ) [ 88 ], protein syok panas 70 dan 60, aB-kristalin, ubiquitin, superoksida dismutase tembaga/seng, dan superoksida dismutase mangan. Protein yang berasal dari Symbiodiniaceae termasuk protein syok panas kecil plastid dan homolog dari protein syok panas kecil kelas I–IV tumbuhan [ 89 ] . Beberapa protein “gelap” yang tidak dianotasi (protein dengan fungsi yang tidak diketahui) mungkin juga menunjukkan janji untuk memantau stres termal. Misalnya, Williams et al. [ 90 ] menunjukkan bahwa protein gelap di M. capitata memiliki peningkatan kelimpahan di bawah tekanan termal jika dibandingkan dengan kondisi sekitar dan koloni liar yang tidak mengalami pemutihan. Protein ini tidak memiliki hit signifikan pada urutan dalam database NCBI nonredundan, yang menunjukkan bahwa ia mungkin memiliki fungsi baru yang sangat spesifik untuk karang. Gen gelap (lihat Kotak ) mewakili sumber target yang kaya (berpotensi terdiri dari sebagian besar protein dalam holobiont) yang dapat digunakan untuk diagnostik dan berpotensi lebih informatif tentang kesehatan ekosistem karena mereka kemungkinan berevolusi sebagai respons terhadap kendala evolusi spesifik yang dihadapi oleh organisme target. Hal ini membuat gen gelap berpotensi menjadi biomarker kesehatan ekosistem yang sangat spesifik. Aktivitas biologis biomarker tidak relevan dengan kegunaannya sebagai biomarker untuk tujuan diagnostik sambil menunggu ia memenuhi kendala sensitivitas dan spesifisitas yang diperlukan untuk memberikan penilaian kesehatan karang yang akurat. Seperti yang disebutkan oleh Parkinson et al. [ 24 ], antibodi poliklonal yang tersedia secara komersial tidak spesifik terhadap karang dan bervariasi dari satu kelompok ke kelompok lain, sehingga sulit untuk menstandardisasi penggunaannya sebagai diagnostik. Selain itu, protein gelap karang tidak memiliki antibodi poliklonal atau monoklonal yang tersedia secara komersial untuk validasi biomarker dan pengembangan pengujian. Oleh karena itu, kemajuan alat berbasis protein bergantung pada pembuatan antibodi monoklonal khusus karang baru (yang menjadikan gen gelap khusus garis keturunan sebagai target yang menjanjikan, misalnya, Stephens et al. [ 91]) atau validasi antibodi monoklonal yang ada yang menargetkan target protein yang dilestarikan. Pekerjaan di masa depan menuju pengembangan uji aliran lateral harus difokuskan pada uji lapangan biomarker protein yang telah divalidasi di berbagai taksa karang dalam pengaturan lab yang terkontrol, seperti HSP60, yang telah divalidasi untuk kemanjurannya dalam mendiagnosis salinitas karang, cahaya, dan stres yang disebabkan oleh suhu (panas dan dingin) [ 41 , 92 – 96 ]. Ada juga kebutuhan mendesak untuk menghasilkan perpustakaan biomarker yang divalidasi yang bersifat prediktif terhadap stres atau ketahanan terhadap stres sebelum pemutihan yang terlihat untuk membantu dalam tindakan intervensi yang ditargetkan untuk pembibitan karang selama gelombang panas laut atau untuk menargetkan koloni yang tahan panas untuk upaya berkebun karang. Meskipun ada keterbatasan ini, respons terhadap pandemi COVID-19 telah memperjelas bahwa platform pengujian POC berbasis antibodi menyediakan alat yang sangat berharga untuk penilaian kesehatan tingkat populasi, yang akan sangat bermanfaat bagi bidang konservasi karang setelah penerapan teknologi tersebut.

4 Implementasi Alat Berbasis Biomarker
Karena inisiatif restorasi karang terus meningkatkan jumlah karang dan spesies yang mereka tangani dan keluasan dan dampak ekologis yang ingin mereka capai, ada kebutuhan yang semakin meningkat untuk alat diagnostik cepat yang menginformasikan tindakan manajemen responsif (yaitu, sistem peringatan dini). Seperti yang terlihat di Karibia selama peristiwa pemutihan dan kematian karang massal tahun 2023, gangguan skala besar berpotensi mengganggu dan menggagalkan upaya restorasi karang dan penelitian penting tentang sistem terumbu karang [ 97 ]. Jika alat untuk meningkatkan prediktabilitas respons fisiologis karang selama periode kritis pemijahan karang dan pemutihan karang, seperti yang dijelaskan di sini, diintegrasikan ke dalam konteks konservasi, mereka akan menawarkan metode baru untuk menanggapi gangguan. Dengan mengevaluasi fisiologi karang secara real-time, sumber daya restorasi dapat digunakan secara lebih proaktif, efisien, dan non-invasif daripada dengan alat yang ada. Akhirnya, data tambahan yang dikumpulkan oleh alat-alat ini dapat dimasukkan ke dalam rencana manajemen dan respons yang ada, dengan ambang batas tingkat populasi atau komunitas untuk metrik baru yang memicu respons manajemen dan/atau mengizinkan kegiatan.

Bahasa Indonesia: Untuk mencapai tujuan yang lebih besar dalam menginformasikan dan menambah upaya restorasi yang sedang berlangsung, perangkat kesehatan karang ini harus dibagikan seluas mungkin dengan komunitas restorasi, dan divalidasi, diulang, dan disesuaikan berdasarkan umpan balik mereka (Gambar 5 ). Kerangka kerja yang dapat digeneralisasikan secara luas untuk memandu penemuan dan validasi biomarker telah diusulkan oleh Parkinson et al. [ 24 ]. Di sini, kami memberikan panduan tentang langkah-langkah yang diperlukan untuk implementasi skala besar. Pertama, praktisi restorasi yang mewakili keragaman geografi dan spesies fokus harus dilatih dalam menggunakan perangkat ini dari pengumpulan sampel awal hingga analisis dan interpretasi data. Instruksi harus langsung jika memungkinkan, dan penyebaran dapat didukung atau ditingkatkan menggunakan modul pelatihan digital, video, dan webinar. Peserta pelatihan harus dilibatkan secara aktif untuk membangun serangkaian respons restorasi yang tepat dengan mempertimbangkan berbagai hasil potensial dari perangkat tersebut. Setelah pelatihan dan penggunaan percontohan di lapangan, umpan balik dari praktisi harus dikumpulkan untuk memvalidasi utilitas perangkat dan memastikan produk memenuhi kebutuhan praktisi lapangan. Mengingat banyaknya upaya pemulihan yang mencakup program sains warga yang aktif untuk membantu penanaman dan pemantauan karang yang telah dipulihkan, perangkat ini juga harus diujicobakan untuk digunakan dalam program-program ini guna mendiversifikasi cara-cara masyarakat dapat terlibat dalam pemulihan karang. Umpan balik dari ilmuwan warga dan praktisi pemulihan harus diintegrasikan ke dalam versi perangkat yang akan datang, dan usulan untuk perangkat baru harus dimanfaatkan untuk meningkatkan teknologi, pelatihan, dan kurikulum. Hasil yang ideal adalah agar program pemulihan di seluruh dunia mengadopsi penggunaan perangkat kesehatan karang ini secara teratur untuk meningkatkan efisiensi dalam operasi dan keterlibatan mereka dengan ilmuwan warga dan masyarakat.

5 Kesimpulan
Pendekatan untuk pemantauan kesehatan karang berkembang pesat dan menjadi lebih tangguh dan multifaset. Membangun perangkat ini dan merencanakan penerapannya mengikuti contoh yang ditetapkan oleh bidang biomedis memanfaatkan pengalaman dan perspektif luas yang ada di bidang kesehatan manusia. Ini akan menghindari penemuan kembali platform pengujian POC yang ada yang perlu diuji dan diterapkan pada model karang. Seperti dijelaskan di atas, mengingat derivasi purba (yaitu, dibandingkan dengan manusia) dan keragaman genetik yang sangat besar dari inang karang dan simbion alga, tantangan pemantauan kesehatan karang harus ditangani secara bertahap. Keterbatasan akan menjadi jelas selama proses berlangsung, seperti kasus perubahan ekspresi biomarker saat karang beradaptasi dengan stres dan menjadi tangguh. Seperti di bidang medis, kita harus menghasilkan sejumlah besar data tingkat populasi dan komunitas untuk mengatasi kompleksitas yang terkait dengan variasi genetik karang dan bagaimana ini berinteraksi dengan komponen holobiont lainnya. Aspek ini menggarisbawahi perlunya mengembangkan perangkat yang murah dan informatif untuk meningkatkan dampak pada konservasi karang.

Kami mengusulkan pendekatan strategis dan bertahap untuk mengembangkan dan menerapkan alat POC berbasis biomarker secara efektif selama dekade berikutnya:

• Sasaran jangka pendek (∼1–5 tahun) : Menjalin kolaborasi antara peneliti, praktisi restorasi, masyarakat setempat, sumber pendanaan swasta dan pemerintah, serta dunia usaha; mengidentifikasi protein dan biomarker metabolit untuk penyakit dan reproduksi yang dapat diintegrasikan ke dalam teknologi POC yang ada; dan melakukan validasi skala besar terhadap biomarker stres termal yang ada.
• Sasaran jangka menengah (∼3–6 tahun) : Melakukan uji coba lapangan skala besar untuk memvalidasi biomarker penyakit dan pemijahan; menentukan sensitivitas dan ambang batas deteksi yang diperlukan untuk setiap populasi target, mengingat hal ini dapat bervariasi antara spesies dan wilayah; dan mengembangkan serta menguji prototipe untuk alat deteksi stres termal.
• Sasaran jangka panjang (∼5–10 tahun) : Menyelesaikan pengembangan, validasi, dan implementasi prototipe POC yang tervalidasi, meningkatkan penerapan dalam program konservasi dan restorasi, dan mengintegrasikan diagnostik berbasis biomarker ke dalam strategi pemantauan terumbu karang rutin.

Pada akhirnya, inovasi dalam diagnostik kesehatan karang harus berasal dari kolaborasi antara penyandang dana, peneliti, praktisi restorasi, bisnis, dan masyarakat. Kemitraan ini akan sangat penting untuk menjembatani kesenjangan finansial dan logistik yang perlu diatasi untuk mendukung upaya restorasi terumbu karang dan melindungi sumber daya yang berharga ini untuk generasi mendatang.