ABSTRAK
Interaksi dengan penyerbuk telah diusulkan sebagai salah satu faktor terpenting yang membentuk keanekaragaman tumbuhan berbunga. Variasi spasial dalam arah tekanan selektif yang diberikan oleh penyerbuk mendorong evolusi diferensiasi adaptif. Oleh karena itu, studi lintas populasi tentang sifat bunga dan interaksi tumbuhan-penyerbuk merupakan langkah penting untuk memahami beragam tekanan selektif yang mendorong evolusi bunga pada angiospermae zoogami. Di sini kami menggabungkan data observasional dan eksperimen lapangan untuk menggambarkan kumpulan penyerbuk, sistem perkembangbiakan, dan sifat imbalan dalam populasi geofit Timur Tengah yang dipelajari, Fritillaria persica . Populasi alami spesies ini mencakup dua morf warna bunga dengan bunga kehijauan atau ungu; pada kedua morf tersebut, nektar dari lingkaran luar ditutupi oleh tepal dari lingkaran dalam. Studi kami mendokumentasikan variasi geografis dalam sistem penyerbukan dari dua morf warna F. persica . Pengunjung yang tercatat di kedua populasi serupa secara kualitatif; namun, kontribusinya bervariasi. Konsentrasi dan profil gula nektar pada umumnya konstan dalam populasi yang dipelajari; kami mencatat perbedaan hanya dalam volume nektar dan konsentrasi asam amino. Hasil ini menunjukkan bahwa variasi yang diamati dalam produksi nektar kemungkinan besar merupakan hasil dari faktor lingkungan daripada seleksi yang dimediasi oleh penyerbuk. Dalam konteks imbalan, kami juga menguji bagaimana mengungkap imbalan nektar tersembunyi dari tepal luar memengaruhi penyerbuk potensial. Mengungkap imbalan tersembunyi tidak mengubah waktu yang dihabiskan dalam satu bunga atau penetrasi perbungaan; namun, itu meningkatkan jumlah biji yang dihasilkan. Sifat nektar dan kesamaan kumpulan penyerbuk menunjukkan bahwa dalam konteks penyerbukan, F. persica merupakan strategi yang agak umum, dan perbedaan yang diamati mungkin disebabkan oleh faktor abiotik.
1 Pendahuluan
Penyerbukan oleh hewan dianggap sebagai interaksi yang paling penting secara ekologis antara tumbuhan dan hewan, karena sering kali krusial bagi keberhasilan reproduksi tumbuhan. Reproduksi 87,5% dari semua spesies tumbuhan liar bergantung pada penyerbukan hewan (Ollerton et al. 2011 ). Biasanya, tumbuhan menyediakan penyerbuk dengan makanan berupa serbuk sari atau nektar. Di antara keduanya, nektar adalah makanan utama yang diberikan kepada penyerbuk di sebagian besar angiospermae dan mungkin yang paling penting dalam konteks evolusi, memainkan peran kunci dalam membentuk hubungan dengan penyerbuk (Brzosko et al. 2021 ; Canto et al. 2011 ; Parachnowitsch et al. 2018 ; Roguz et al. 2018 , 2021 ; Roy et al. 2017 ; Simpson and Neff 1981 ). Jumlah, komposisi, dan aksesibilitas nektar merupakan hal yang penting bagi ekologi penyerbukan, karena hal tersebut memengaruhi perilaku dan preferensi penyerbuk dan pada akhirnya memengaruhi keberhasilan reproduksi tanaman (Palmer-Young et al. 2019 ; Parachnowitsch et al. 2018 ; Willmer 2011 ). Sifat nektar berkontribusi pada pembelajaran penyerbuk jika sinyalnya jujur, yaitu, terdapat korelasi positif antara jumlah dan konsentrasi dengan sinyal bunga. Oleh karena itu, sifat nektar dianggap berada di bawah seleksi yang dimediasi penyerbuk (Eisen et al. 2023 ; Ortiz et al. 2021 ; Parachnowitsch et al. 2018 ; Schaefer et al. 2004 ).
Secara fungsional, nektar adalah larutan air kaya nutrisi yang sebagian besar mengandung gula, serta konsentrasi rendah asam amino (AA), protein, lemak, asam organik, dan komponen minor lainnya seperti mineral, vitamin, dan minyak (Nicolson dan Thornburg 2007 ). Komposisi gulanya dapat sangat bervariasi tergantung pada spesies tanaman (Herrera et al. 2006 ), sering kali berupa campuran glukosa, fruktosa, dan sukrosa dalam proporsi yang bervariasi, dengan sukrosa menjadi komponen utama (Lotz dan Schondube 2006 ). Perbedaan konsentrasi gula memiliki implikasi untuk interaksi tanaman-penyerbuk, karena dapat dikaitkan dengan preferensi penyerbuk untuk sifat tertentu, tantangan yang terkait dengan penanganan nektar kental/padat, dan strategi alokasi energi tanaman yang ditujukan untuk meminimalkan biaya produksi nektar (Lanza et al. 1995 ). Selain itu, konsentrasi gula memainkan peran utama dalam reaksi langsung tanaman terhadap penyerbuknya, karena jumlah gula dalam nektar dapat meningkat dalam hitungan menit (Veits et al. 2019 ).
Setelah gula, AA adalah konstituen paling melimpah kedua dalam nektar bunga. Kehadiran AA dan konstituen non-gula lainnya memperkaya nektar bunga dengan nilai gizi lebih dari sekadar sumber energi kimia sederhana (Nepi 2014 ). AA biasanya ditemukan dalam nektar dalam jumlah rendah tetapi terukur (0,02%–4,8% bahan organik), dan telah diusulkan sebagai salah satu fitur terpenting yang membentuk interaksi tanaman-penyerbuk (Fornoff et al. 2017 ). Nektar bunga berfungsi sebagai sumber asam amino esensial (EAA), yang sangat penting untuk pertumbuhan, pemeliharaan somatik, dan reproduksi (Mevi-Schütz dan Erhardt 2005 ). Selain itu, jalur degradasi prolin oksidatif menggunakan prolin sebagai sumber energi, khususnya selama fase awal penerbangan serangga (Carter et al. 2006 ; Teulier et al. 2016 ).
Konsentrasi dan komposisi nektar merupakan sifat yang sangat bervariasi dan menimbulkan pertanyaan paling menarik mengenai evolusi adaptif sifat bunga. Masih diperdebatkan apakah keberadaan dan proporsi komponen nektar bersifat adaptif dalam kaitannya dengan jenis penyerbuk, dan apakah komposisi nektar ditentukan oleh filogeni, atau merupakan konsekuensi sekunder dari morfologi bunga dan faktor lingkungan (Willmer 2011 ). Konsentrasi dan komposisi nektar dapat bervariasi dalam bunga dan perbungaan, antara individu, dan di antara populasi. Perbedaan antarspesies dalam volume nektar, gula, dan konsentrasi serta komposisi AA sering ditafsirkan sebagai adaptasi terhadap preferensi penyerbuk (Parachnowitsch et al. 2018 ; Willmer 2011 ).
Teori Stebbins menyatakan bahwa seleksi pada sifat-sifat bunga didorong oleh penyerbuk yang paling efisien, menyiratkan bahwa adaptasi sifat-sifat bunga dapat menunjukkan spesifisitas penyerbuk (Stebbins 1970 ). Seleksi ini dapat dicerminkan oleh sifat-sifat nektar (Dellinger et al. 2019 , 2021 ; Shrestha et al. 2019 ; Sletvold et al. 2016 ). Selain itu, kumpulan penyerbuk yang berinteraksi dengan komunitas tanaman tertentu dapat bervariasi dalam komposisi spesies atau proporsi (komponen kuantitas; Gómez et al. 2009 ; Gómez dan Zamora 2006 ; Zhao dan Huang 2013 ). Selain itu, perilaku dan efektivitas penyerbuk dapat berbeda di antara populasi (komponen kualitas; Hersch dan Roy 2007 ; Zych et al. 2019 ).
Seleksi pada sifat-sifat bunga yang membentuk interaksi dengan penyerbuk diperkirakan lebih kuat dalam sistem penyerbukan khusus dibandingkan dengan yang umum (Aigner 2001 ; Johnson dan Steiner 2000 ). Meskipun demikian, bahkan pada spesies generalis, dapat ada perubahan terkait penyerbukan pada sifat-sifat bunga yang mengarah ke “spesialisasi kriptik” (Bell 1971 ), biasanya diekspresikan dalam mosaik sifat-sifat bunga yang terkait dengan komunitas penyerbuk (Thompson 1999 ). Pada beberapa spesies generalis, yang diserbuki oleh kelompok fungsional penyerbuk yang berbeda, ada sedikit bukti untuk ekotipe penyerbukan yang berbeda, dan variasi yang diamati dalam fitur-fitur bunga ditafsirkan sebagai “pengembaraan adaptif” (Zych et al. 2019 ). Dalam proses ini, populasi yang berbeda dari spesies yang sama dapat menyimpang sebagai respons terhadap komunitas penyerbuk lokal. Hal ini tidak mengakibatkan pergeseran penyerbuk karena arah dan kekuatan tekanan selektif bekerja terlalu singkat untuk menyebabkan perubahan morfologi dan fenotipik yang substansial (Wilson dan Thomson 1991 ).
Tumbuhan dapat menjadi plastis dalam produksi nektarnya, merespons berbagai faktor lingkungan seperti kekeringan (Waser dan Price 2016 ), kelembapan dan suhu sekitar (Bertsch 1983 ; Petanidou et al. 2006 ; Petanidou dan Smets 1996 ), sifat tanah (Gardener dan Gillman 2001 ; Ryniewicz et al. 2020 ), peningkatan CO2 ( Dag dan Eisikowitch 2000 ), interaksi dengan herbivora (Aizen dan Raffaele 1996 ) atau mikroba nektar (Vannette 2020 ). Perubahan yang tercatat pada sifat nektar yang disebabkan oleh iklim mikro di sekitarnya menunjukkan bahwa nektar dapat menjadi sangat sensitif dan menunjukkan perubahan dalam pengukuran fenotipik. Namun, ada juga penelitian yang menunjukkan bahwa pada beberapa spesies, sifat nektar mungkin kurang dipengaruhi oleh faktor lingkungan (Lehtilä dan Strauss 1997 ).
Keragaman mosaik seleksi yang mungkin terjadi dalam konteks variasi spasial mengindikasikan perlunya studi lebih lanjut jika kita ingin memahami keanekaragaman tumbuhan berbunga. Variasi interspesifik dalam sifat bunga, karakteristik nektar, dan interaksi tumbuhan-penyerbuk merupakan langkah penting dalam memahami tekanan selektif beragam yang mendorong evolusi bunga dalam angiospermae zoogami (Aigner 2004 ; Chapurlat et al. 2015 ; Herrera et al. 2006 ). Di sini, kami menguji kemungkinan hubungan antara variasi intraspesifik dalam sifat imbalan dan variasi dalam sistem penyerbukan bunga lili Persia, Fritillaria persica L. (Liliaceae). Ini adalah tanaman umbi hias, yang termasuk dalam subgenus monotipe Theresia Koch dari genus Fritillaria (Day et al. 2014 ). Spesies ini asli Mediterania Timur dan Asia Barat (Iran, Irak, Turki, Siprus, Suriah, Israel, Palestina, dan Yordania) dengan perbungaan yang luar biasa besar, sering kali berisi lebih dari selusin bunga (Tekşen dan Aytaç 2011 ). Sementara di sebagian besar populasi di Timur Tengah, bunganya hampir monomorfik, krem, atau krem kehijauan, beberapa populasi menunjukkan polimorfisme warna, dengan warna bunga bervariasi dari ungu tua atau pucat hingga ungu kehijauan, putih, atau jarang krem, pada skala warna berkelanjutan (Gambar 1A,B ). Fritillaria persica memiliki susunan organ reproduksi yang khas; itu adalah satu-satunya spesies Fritillaria yang diketahui di mana bagian dari hadiah nektar tersembunyi—nektarium tepal luar dilindungi oleh tepal bagian dalam dan kemungkinan tidak mudah diakses oleh serangga yang berkunjung (Roguz et al. 2018 ; Gambar 1C ). Saat ini, biologi reproduksi F. persica hampir tidak diketahui dan, hingga saat ini, interaksi tanaman-penyerbuk pada spesies ini dalam populasi alami belum pernah dipelajari. Adanya polimorfisme warna dan populasi yang terletak pada jarak spasial yang bervariasi menjadikan Fritillaria persica sistem yang sangat baik untuk mempelajari variasi spasial dalam fitur bunga dan sistem penyerbukan. Selain itu, spesies ini memiliki susunan bagian reproduksi yang khas jika dibandingkan dengan perwakilan genus lainnya. Data yang tersedia menunjukkan bahwa spesies ini diserbuki oleh lebah (Roguz et al. 2018 ), dan berdasarkan sifat imbalan dan susunan bagian reproduksi, kemungkinan besar merupakan model penyerbukan semi-umum. Dalam penelitian ini, kami mengeksplorasi sistem perkembangbiakan, sifat nektar, dan kumpulan penyerbuk dalam populasi F. persicaKami secara eksperimental memanipulasi aksesibilitas penyerbuk ke nektar untuk menilai peran yang dimainkan oleh akses terbatas ke hadiah. Kami bertujuan untuk menjawab pertanyaan-pertanyaan berikut: (1) Apakah ada perbedaan dalam sifat hadiah di antara populasi dengan warna bunga yang berbeda? (2) Jika ya—bagaimana perbedaan karakteristik nektar ini memengaruhi interaksi dengan penyerbuk dan berkontribusi pada sistem penyerbukan khusus F. persica ? (3) Apa peran nektar tersembunyi dalam interaksi dengan penyerbuk?
2 Bahan dan Metode
2.1 Sistem Studi
Fritillaria persica L. menghasilkan bunga berbentuk lonceng, tumbuh dalam kelompok padat pada ras piramidal di sepanjang batang berdaun. Setiap ras menghasilkan 10–50 bunga kecil, dengan panjang perigon 10–20 mm. Fritillaria persica secara morfologis androdioecious, dengan spesimen berbunga memiliki ras yang hanya terdiri dari bunga dengan morf seksual yang sama, baik hermafrodit atau jantan (Mancuso dan Peruzzi 2010 ). Bunga terbuka secara berurutan pada batang dan biasanya terbuka selama beberapa hari. Stigma reseptif sepanjang pembungaan, dan serbuk sari tersedia selama beberapa hari, tergantung pada aktivitas pengunjung, hingga kepala sari pecah (Mancuso dan Peruzzi 2010 ).
Fritillaria persica memiliki susunan organ reproduksi yang khas. Posisi benang sari berubah sepanjang masa hidup bunga, dimulai dari posisi perifer yang hampir menempel pada kelopak, secara bertahap bergeser ke arah tengah, dan akhirnya bersentuhan dengan kepala putik, meletakkan serbuk sari di atasnya (Roguz et al. 2018 ). Selain itu, susunan bagian reproduksi bervariasi di antara bunga-bunga dalam satu perbungaan. Pada bunga-bunga perbungaan yang lebih rendah, kepala putik lebih panjang dari kepala sari, sedangkan pada bunga-bunga di tengah perbungaan, kepala putik dan kepala sari memiliki panjang yang sama, dan benang sari menyentuh kepala putik. Pada bunga-bunga teratas perbungaan, kepala putik hampir setengah panjang kepala sari dan kadang-kadang mengalami degenerasi. Penyerbukan sendiri secara spontan tidak tercatat di F. persica , tetapi setidaknya sebagian kompatibel dengan dirinya sendiri (Mancuso dan Peruzzi 2010 ).
Bunga F. persica menghasilkan nektar dalam jumlah yang cukup sedikit, tetapi karena satu tanaman menghasilkan beberapa lusin bunga yang sebagian besar mekar pada saat yang sama, hasilnya secara keseluruhan relatif melimpah. Nektar didominasi oleh heksosa dan satu bunga menghasilkan, rata-rata, 4,3 ± 4,5 μL nektar dengan konsentrasi gula 46,5% ± 18,7% (Roguz et al. 2018 ). Nektar F. persica mengandung AA dalam jumlah yang relatif sedikit, dengan glutamin sebagai yang paling melimpah (Roguz et al. 2019 ).
2.2 Lokasi Lapangan dan Pengambilan Sampel
Pekerjaan lapangan dilakukan pada tahun 2019 pada dua populasi yang berlokasi di Israel (jarak garis lurus antara populasi sekitar 85 km; diambil dari https://earth.google.com ). Tanaman yang tumbuh di dua populasi studi memiliki dua warna bunga yang berbeda. Lokasi lapangan pertama berlokasi di hutan eukaliptus Hakoach, dekat Rosh Ha’ayin ( selanjutnya disebut Rosh; 32°05′58.7″ N 34°59′04.0″ E). Populasi ini terletak pada 80 m di atas permukaan laut di dalam hutan pinus yang ditanami, menerima curah hujan tahunan rata-rata 580 mm dan kelembaban relatif rata-rata 51%. Suhu harian rata-rata adalah 21°C (suhu harian minimum dan maksimum masing-masing 16°C dan 26°C). Tanahnya adalah terra rossa, tanah liat merah, yang melapisi batu kapur ( https://ims.gov.il/en/ClimateAtlas ). Meliputi area seluas sekitar 500 m2 , populasi ini diperkirakan terdiri dari sekitar 400 tanaman individu, dengan warna bunga berkisar dari hijau hingga krem.
Populasi kedua berlokasi di Gurun Yudea, dekat Arad (selanjutnya disebut Arad; 31°20′44.6″ N 35°07′21.8″ E). Populasi Arad berlokasi pada ketinggian 600 m di atas permukaan laut di lingkungan semak belukar gurun dengan curah hujan tahunan rata-rata 135 mm dan kelembaban relatif rata-rata 37%. Daerah tersebut mengalami suhu harian rata-rata 19°C (suhu harian minimum dan maksimum masing-masing 14°C dan 25°C). Tanahnya terdiri dari loess—debu gurun halus—yang diendapkan di atas kapur ( https://ims.gov.il/en/ClimateAtlas ). Vegetasi dominan meliputi Artemisia herba-alba dan Thymelaea hirsuta , yang merupakan ciri khas ekosistem semak belukar gurun. Populasi ini mencakup luas sekitar 2 km2 dan berisi sekitar 30.000 tanaman individu, dengan sebagian besar warna bunga berwarna ungu.
Pada setiap populasi, tanaman penelitian dipilih secara acak dengan berjalan melalui area tersebut dan berhenti pada interval acak untuk memilih tanaman tanpa penilaian sebelumnya, untuk memastikan pemilihan yang tidak bias. Untuk mencegah pengambilan sampel berulang dari area yang sama, tanaman dipilih dengan jarak minimal 1 m, dengan lokasi pengambilan sampel bervariasi pada setiap panen berikutnya. Kami melakukan kerja lapangan hanya dalam kondisi cuaca baik (tidak ada angin, tidak ada hujan), antara 14 dan 26 Februari 2020 di Rosh dan antara 3 dan 24 Maret 2020 di Arad, selama waktu puncak pembungaan setiap populasi yang diteliti. Waktu pengumpulan nektar sama dengan pengamatan serangga pengunjung.
2.3 Pengumpulan dan Analisis Nektar
Kami mengumpulkan nektar dari fritillaria di kedua populasi untuk menentukan perbedaan potensial dalam karakteristik nektar pada beberapa level: antar populasi (perbandingan berdasarkan data bunga tunggal) dan antar spesimen dalam populasi (222 sampel di Rosh dan 104 di Arad), dalam inflorescence (46 inflorescence di Rosh dan 33 di Arad) dan satu bunga (lingkaran dalam vs. luar; 41 bunga di Rosh dan 65 di Arad). Secara total, kami mengumpulkan 263 sampel nektar di Rosh dan 169 sampel nektar di Arad. Perbedaan dalam upaya pengambilan sampel antar populasi disebabkan oleh kerusakan berulang dari pengaturan eksperimen oleh para penggembala lokal. Kami memilih tanaman selama tahap kuncup dan mengantonginya dengan jaring nilon untuk mencegah kunjungan serangga. Kami memeriksa kemajuan pembungaan setiap hari di pagi dan sore hari, dan kami mengambil sampel nektar selama antesis tetapi sebelum dehiscence antera. Kami mengumpulkan nektar dengan pipet mikrokapiler dari nektari dari semua enam tepal dan menggabungkannya sebagai satu sampel per bunga. Untuk 43 bunga di Rosh dan 50 bunga di Arad, kami mengumpulkan nektar secara terpisah dari lingkaran luar dan dalam untuk memeriksa kemungkinan perbedaan. Kami mengumpulkan nektar dari empat bunga pertama yang mekar pada spesimen yang paling banyak diambil sampelnya. Untuk beberapa spesimen, kami mengumpulkan nektar dari semua bunga di perbungaan untuk memeriksa kemungkinan korelasi antara posisi di perbungaan dan produksi nektar. Kami menggunakan mikrokapiler terkalibrasi untuk mengukur volume nektar.
Nektar yang terkumpul kemudian dikeluarkan dari kapiler mikro ke dalam tabung Eppendorf. Sampel dibekukan (−20°C) hingga diproses lebih lanjut. Kami menggunakan prisma refraktometer RL-4 (PZO, Polandia) untuk mengukur konsentrasi gula nektar. Nektar yang tersisa digunakan untuk menilai komposisi gula nektar dan AA dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC, deskripsi metode Informasi Pendukung S1 ).
2.4 Sistem Pemuliaan
Kami menandai 64 tanaman secara acak di setiap populasi untuk mempelajari sistem perkembangbiakannya. Kami menandai empat bunga terendah pada setiap tanaman dan menempatkannya secara acak ke salah satu dari empat perlakuan: (1) penyerbukan sendiri spontan—bunga dibungkus dengan kasa halus untuk mencegah serangga datang; (2) penyerbukan sendiri—bunga dibungkus pada tahap kuncup dan kami menyerbukinya secara manual dengan serbuk sarinya sendiri (berasal dari bunga yang sama); (3) penyerbukan silang tambahan—kami memindahkan serbuk sari secara manual dari donor setidaknya 1 m jauhnya ke lobus stigma reseptif; dan (4) penyerbukan terbuka (kontrol). Bunga percobaan dibiarkan di ladang, dan kami mengumpulkan buah setelah matang.
2.5 Kunjungan Serangga
Kami secara acak memilih 91 inflorescence di Rosh dan 93 inflorescence di Arad dan merekamnya selama 1 jam menggunakan empat kamera digital secara bersamaan. Setelah istirahat 1 jam, kami memulai perekaman berikutnya. Pengamatan dilakukan terutama dari pukul 9.00 pagi hingga 6.00 sore, tetapi kami juga merekam bunga sebelum matahari terbit dan beberapa jam setelah matahari terbenam pada beberapa hari. Total waktu perekaman adalah 110 jam pada siang hari dan 11,5 jam sebelum matahari terbit dan setelah matahari terbenam. Kami menganalisis identitas pengunjung bunga di lab dengan menugaskan serangga ke morfogroup seperti lalat melayang, lebah madu ( Apis mellifera ), Eucera (betina), lebah soliter (selain Eucera ), dan Xylocopa . Selain itu, kami mencatat jumlah bunga di inflorescence yang dikunjungi oleh setiap pengunjung dan waktu yang dihabiskan oleh pengunjung dalam satu bunga. Kami juga menganalisis perilaku pengunjung bunga, apakah mencari nektar dan/atau serbuk sari. Perbungaan tidak dikecualikan dari putaran berikutnya, yang dapat menyebabkan perbungaan yang sama diamati lebih dari satu kali.
2.6 Manipulasi Eksperimental Akses terhadap Nektar
Akses ke nektar di tepal luar bunga F. persica dibatasi karena tepal bagian dalam menutupi nektar besar (Gambar 1C ). Untuk menyelidiki peran ekologis fitur ini, kami melakukan eksperimen di kedua populasi studi dengan mengungkap hadiah yang tersedia di lingkaran luar tepal. Kami secara acak memilih 24 tanaman dari setiap populasi dan menghilangkan bagian tepal bagian dalam yang menutupi nektar tepal luar di empat bunga pertama. Kami mencatat aktivitas penyerbuk pada bunga percobaan—waktu yang dihabiskan di satu bunga dan penetrasi perbungaan (jumlah bunga yang dikunjungi selama satu kunjungan dibagi dengan jumlah bunga di seluruh perbungaan). Di akhir musim, kami menghitung jumlah benih yang dihasilkan.
2.7 Analisis Statistik
Kami melakukan analisis data menggunakan R 4.0.3 (Tim Inti R 2021 ). Pertama, kami menilai kenormalan data residual dalam model linier yang digunakan menggunakan uji Shapiro–Wilk. Karena asumsi kenormalan tidak terpenuhi, bahkan setelah transformasi yang tepat diterapkan, kami menggunakan uji ANOVA Kruskal-Wallis (selanjutnya disebut KW) untuk menentukan perbedaan dalam produksi nektar dan frekuensi kunjungan serangga ke bunga. Untuk menyelidiki apakah konsentrasi dan volume gula nektar bergantung pada posisi bunga dalam perbungaan, kami menggunakan korelasi peringkat Kendall (fungsi “Kendall” dalam paket Kendall; McLeod 2022 ). Kami menganalisis variasi komposisi asam amino antara populasi studi menggunakan PERMANOVA berdasarkan jarak Bray–Curtis (fungsi “adonis2” dalam paket vegan; Oksanen et al. 2022 ). Selanjutnya, kami menggunakan fungsi ‘envfit’ menggunakan ordinasi NMDS untuk mengidentifikasi asam amino mana yang mendorong perbedaan yang diamati (paket vegan; Oksanen et al. 2022 ). Untuk memverifikasi bahwa perbedaan ini disebabkan oleh pergeseran lokasi centroid daripada perbedaan dispersi, kami melakukan analisis homogenitas dispersi (fungsi “betadisper” dalam paket vegan; Oksanen et al. 2022 ). Kami menghitung indeks keterbatasan serbuk sari (PLI =
(jumlah biji pada penyerbukan silang suplemen—jumlah biji pada kontrol)/jumlah biji pada penyerbukan silang suplemen) dan keterbatasan penyerbuk (POLI =
(jumlah buah pada penyerbukan silang tambahan—jumlah buah pada kontrol)/jumlah buah pada penyerbukan silang tambahan; Campbell dan Husband 2007 ). PLI dihitung sebagai nilai rata-rata indeks keterbatasan serbuk sari yang dihitung untuk individu yang diteliti dan POLI dihitung sebagai nilai rata-rata individu yang diteliti.
3 Hasil
3.1 Produksi Nektar
Jumlah nektar yang diproduksi oleh bunga di Rosh lebih tinggi daripada di Arad (rata-rata ± SE: 23,0 ± 1,16 μL dan 5,65 ± 1,03 μL, berturut-turut; KW chi-kuadrat = 118, df = 1, p < 0,01; Gambar 2A , Tabel 1 ). Namun, konsentrasi nektar tidak berbeda antara lokasi (20,8% ± 2,55% dan 22,9% ± 0,55%, berturut-turut; KW chi-kuadrat = 0,49, df = 1, p = 0,48; Gambar 2A , Tabel 1 ). Gula dominan dalam nektar kedua populasi adalah fruktosa, yang mencakup sekitar 50%, diikuti oleh glukosa dan sukrosa, dengan proporsi yang sama di kedua populasi (Gambar 2B ).
| Volume (μL) | Konsentrasi (%) | Jumlah fruktosa (μg) | Jumlah glukosa (μg) | Jumlah sukrosa (μg) | Asam amino (pmol/μL) | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Sifat-sifat nektar (perbandingan antar populasi) | ||||||
| Rosh | 23,0 ± 1,16 (222) | 22,9 ± 0,55 (157) | 78,5 ± 1,25 (124) | 48,1 ± 1,04 (124) | 26,7 ± 0,40 (124) | 589 ± 6,12 (124) |
| Kota Arad | 5,65 ± 1,03 (104) | 20,8 ± 2,55 (7) | 68,4 ± 0,72 (77) | 40,7 ± 0,65 (77) | 6,87 ± 0,27 (77) | 359 ± 6,71 (77) |
| Tes | Peringkat KW-jumlah | Peringkat KW-jumlah | Peringkat KW-jumlah | Peringkat KW-jumlah | Peringkat KW-jumlah | Peringkat KW-jumlah |
| nilai p | < 0,01 | 0.48 | < 0,001 | < 0,001 | < 0,001 | < 0,001 |
| Rosh | Kota Arad | |
|---|---|---|
| Sifat-sifat nektar (perbandingan dalam populasi) | ||
| Volume tepal bagian dalam (μL) | 18,8 ± 2,03 (25) | 1,20 ± 0,19 (22) |
| Volume tepal luar (μL) | 12,5 ± 2,18 (24) | 2,31 ± 0,45 (22) |
| Tes | Peringkat KW-jumlah | Peringkat KW-jumlah |
| P | 0,02 | 0,05 |
| Konsentrasi tepal bagian dalam (%) | 25,4 ± 1,42 (24) | Bahasa Indonesia |
| Konsentrasi tepal luar (%) | 22,7 ± 1,36 (25) | Bahasa Indonesia |
| Tes | Peringkat KW-jumlah | Bahasa Indonesia |
| P | 0.40 | Bahasa Indonesia |
| Asam amino bagian dalam tepal (pmol/μL) | 362 ± 17,6 (26) | 594 ± 14 (22) |
| Asam amino tepal luar (pmol/μL) | 350 ± 20,6 (24) | 582 ± 20,4 (24) |
| Tes | Peringkat KW-jumlah | Peringkat KW-jumlah |
| P | 0,99 | 0.76 |
| Konsentrasi (%) | Volume (μL) | |||
|---|---|---|---|---|
| Rosh | Kota Arad | Rosh | Kota Arad | |
| Sifat nektar versus posisi di perbungaan | ||||
| tahu | 0,07 (222) | 0,58 (7) | -0,09 (222) | -0,05 (104) |
| P | 0.19 | 0.11 | 0,06 | 0.47 |
| Tes | Korelasi peringkat Kendall | Korelasi peringkat Kendall | ||
| Kecenderungan sifat nektar dalam satu tanaman | ||||
| tahu | -0,004 | 0,79 | 0.18 | -0,02 |
| P | 0,94 | 0,03 | < 0,01 | 0,80 |
| Tes | Korelasi peringkat Kendall | Korelasi peringkat Kendall | ||
Pada Rosh, bunga menghasilkan lebih banyak nektar di lingkaran luar dibandingkan dengan lingkaran dalam (18,8 ± 2,03 μL dan 12,5 ± 2,18 μL, berturut-turut; KW chi-kuadrat = 5,72, df = 1, p = 0,02), sementara pada Arad, bunga menghasilkan jumlah nektar yang sama baik di lingkaran dalam maupun luar (masing-masing 1,20 ± 0,19 μL dan 2,31 ± 0,45 μL; KW chi-kuadrat = 3,96, df = 1, p = 0,05). Tidak ada perbedaan dalam konsentrasi nektar antara lingkaran luar dan dalam di Rosh (22,7% ± 1,36% dan 25,4% ± 1,42%, masing-masing; KW chi-kuadrat = 0,71, df = 1, p = 0,40; Tabel 1 ). Di Arad, data tidak cukup untuk menarik kesimpulan (produksi nektar yang rendah pada bunga Arad membatasi jumlah nektar yang dapat diambil sampelnya untuk konsentrasi gula, selain itu, ukuran sampel dibatasi karena pengaturan eksperimen berulang kali rusak).
Jumlah maksimum bunga yang diambil sampelnya dalam satu inflorescence adalah 17 di Rosh, sementara di Arad, jumlahnya enam. Konsentrasi dan volume gula nektar tidak bervariasi dengan posisi bunga dalam inflorescence (dari bawah ke atas) di Rosh (korelasi peringkat Kendall, t = −0,09, p = 0,06 dan t = 0,07, p = 0,19 untuk volume dan konsentrasi, secara retrospektif). Hal yang sama diamati untuk Arad, di mana baik volume maupun konsentrasi nektar tidak menunjukkan hubungan dengan posisi ( t = 0,58, p = 0,11 dan t = −0,05, p = 0,47). Pada tanaman dari Rosh, kami mengamati kecenderungan produksi nektar dalam satu inflorescence hanya untuk volume nektar ( t = −0,18, p < 0,01), tetapi tidak untuk konsentrasi (t = −0,004, p = 0,94). Sebaliknya, untuk tanaman yang tumbuh di Arad, kami memperoleh hasil yang berlawanan dengan kecenderungan dalam perbungaan yang hadir dalam konsentrasi ( t = 0,79, p = 0,03) dan tidak ada dalam volume ( t = −0,02, p = 0,80; Tabel 1 ).
Kami mengidentifikasi 26 AA dalam proporsi yang bervariasi (Tabel 2 ). Jumlah total AA dalam nektar lebih tinggi di Rosh dibandingkan dengan Arad (rata-rata per bunga 589 ± 118 pmol/μL dan 359 ± 97,4 pmol/μL, berturut-turut). Juga, jumlah rata-rata AA spesifik di semua kecuali satu lebih tinggi di Rosh ( p < 0,001, Tabel 2 ; Informasi Pendukung S2 ). Analisis komponen utama (PCA) menjelaskan 46,3% dan 11,4% dari total variasi pada dua sumbu pertama, berturut-turut (Gambar 2C ). Di Rosh, alanin adalah AA yang paling melimpah, diikuti oleh glutamin dan lisin, sementara di Arad, glutamin adalah AA yang paling melimpah, diikuti oleh glisin dan lisin. Kami tidak mengamati perbedaan dalam jumlah total AA dalam nektar yang diproduksi oleh lingkaran dalam dan luar. Jumlah total rata-rata di Rosh adalah 594 ± 14 pmol/μL dan 582 pmol/μL di tepal bagian dalam dan luar, masing-masing (KW chi-kuadrat = 0,09, df = 1, p = 0,76), sementara di Arad, adalah 362 ± 17,6 pmol/μL dan 350 ± 20,6 pmol/μL di tepal bagian dalam dan luar, masing-masing (KW chi-kuadrat = 0,00, df = 1, p = 0,99; Tabel 1 ).
| Asam amino | Rosh | Kota Arad | Chi-kuadrat | P |
|---|---|---|---|---|
| Asam α-Aminobutyric | 6.67 | 3.66 | 24.0 | < 0,001 |
| Alanin | 65.32 | 21.97 | 90.6 | < 0,001 |
| Arginin | 9.35 | 6.35 | 34.3 | < 0,001 |
| Asparagin | 18.58 | Tanggal 13.01 | 6.15 | 0,013 |
| Asam aspartat | 18.58 | Tanggal 11.01 | 37.1 | < 0,001 |
| Asam β-Aminobutyric | 5.59 | 3.42 | 22.2 | < 0,001 |
| Sitrulin | 14.66 | 8.70 | 35.8 | < 0,001 |
| Sistin | 17.79 | tanggal 13.04 | 34.1 | < 0,001 |
| Asam gamma-aminobutyric | 9.51 | 6.58 | 22.0 | < 0,001 |
| Glutamin | 36.44 | 29.54 | 3.70 | 0,0545 pukul 0,0545 |
| Asam glutamat | 51.75 | 32.31 | 17.9 | < 0,001 |
| Glisin | 27.92 | 15.72 | 77.4 | < 0,001 |
| Histidin | 18.39 | 11.52 | 22.3 | < 0,001 |
| Isoleusin | tanggal 20.09 | Tanggal 13.19 | 44.5 | < 0,001 |
| Leusin | 48.70 | 23.86 | 84.3 | < 0,001 |
| Lisin | 51.24 | 25.72 | 80.4 | < 0,001 |
| Metionina | tanggal 15.09 | 6.87 | 82.7 | < 0,001 |
| Ornitin | 48.90 | 21.98 | 90.9 | < 0,001 |
| Fenilalanin | pukul 11.15 | 7.86 | 40.0 | < 0,001 |
| Prolin | 10.97 | 7.41 | 24.9 | < 0,001 |
| Serin | 23.26 | 28.44 | 13.5 | 0,0002 |
| taurin | 10.53 | 5.82 | 47.0 | < 0,001 |
| Treonin | 13.73 | 7.77 | 57.3 | < 0,001 |
| Triptofan | 33.19 | 18.23 | 84.9 | < 0,001 |
| Tirosin | Jam 8.45 | tanggal 04.03 | 34.6 | < 0,001 |
| Valin | 4.88 | 10.97 | 63.5 | < 0,001 |
Hasil penelitian menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan secara statistik dalam komposisi asam amino antara populasi penelitian (PERMANOVA: F = 103, R 2 = 0,35, p < 0,001), yang menjelaskan sekitar 35% variasi dalam data. Uji homogenitas dispersi multivariat tidak signifikan ( F = 1,7, p = 0,19), yang menunjukkan bahwa perbedaan yang diamati dalam komposisi asam amino di antara populasi tidak mungkin didorong oleh perbedaan dalam dispersi dalam kelompok. Hasil ini memberikan bukti kuat bahwa komposisi komunitas bervariasi secara signifikan di antara kelompok-kelompok karena perbedaan dalam centroid kelompok (yaitu, komposisi komunitas rata-rata), daripada variabilitas yang tidak sama dalam kelompok. Analisis mengungkapkan bahwa semua kecuali satu asam amino berbeda secara signifikan antara dua populasi yang dipelajari, yang menunjukkan profil asam amino yang berbeda yang terkait dengan setiap populasi.
Di laboratorium, nektar diencerkan dengan air hingga volume 50 μL (10 μL nektar +40 μL air). Sampel disaring melalui kolom putar menggunakan filter membran berpori 0,4 μm sebelum disuntikkan. Supernatan kemudian dimasukkan ke dalam sisipan. Sistem HPLC Agilent 1260 Infinity Series dengan autoinjector, kompartemen autosampler berpendingin, kompartemen kolom termostat, pompa kuartener dengan degasser vakum sebaris, dan detektor indeks bias digunakan. Kolom Analisis Karbohidrat ZORBAX (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) digunakan untuk pemisahan dan analisis gula. Sampel alikuot 10 μL atau larutan standar disuntikkan. Pemisahan dilakukan pada suhu 30°C dengan fase mobil yang terdiri dari asetonitril:air (70:30, v/v) pada laju alir 1,4 mL/menit. Data analisis diintegrasikan menggunakan perangkat lunak Agilent OpenLab CDS ChemStation untuk sistem kromatografi cair (LC). Identifikasi gula dilakukan dengan membandingkan waktu retensi masing-masing gula dalam larutan referensi dengan larutan uji. Kandungan glukosa, fruktosa, dan sukrosa dianalisis berdasarkan perbandingan luas puncak yang diperoleh untuk sampel.
Nektar yang terkumpul juga dianalisis untuk mengetahui komposisi asam amino (AA) nektar dengan menggunakan HPLC. Setelah mencairkan sampel hingga mencapai suhu sekitar, nektar diencerkan hingga mencapai volume 20 μL (10 μL nektar dicampur dengan 10 μL air suling). Sampel disaring melalui kolom putar dengan filter membran berpori 0,4 μm (A&A Biotechnology, Polandia) sebelum disuntikkan dengan sentrifugasi selama 2 menit pada 9000 g (gaya sentrifugal relatif). Supernatan dimasukkan ke dalam sisipan dan dianalisis dengan HPLC. Sampel dianalisis menggunakan sistem seri Agilent Technologies 1260 Infinity yang terdiri dari pompa Quaternary Agilent 1260 Infinity G1311B, Detektor Dioda Array (DAD) 1260 Infinity G1315D, Detektor Fluoresensi (FLD) 1260 Infinity G1321B, Injektor Sampel Otomatis ALS G1329B 1260 Infinity, Termostat Autosampler G1330B 1290 Infinity, dan oven kolom termostat 1290 Infinity TCC G1316C. Sistem dikontrol oleh perangkat lunak Agilent OpenLab ChemStation. Analisis AA dalam 10 μL alikuot nektar yang dikumpulkan dari bunga dilakukan dengan HPLC gradien menggunakan kolom Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 (4,6 × 150 mm, 5 μm) dengan pelindung, yaitu Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 (4,6 × 12,5 mm, 5 μm). Ekstrak yang mengandung AA primer dan sekunder diderivatisasi terlebih dahulu di kolom dengan reagen o-ftalaldehid (OPA) dan 9-fluorenilmetil kloroformat (FMOC). Program injektor digunakan untuk derivatisasi. Setelah derivatisasi, campuran masing-masing sampel disuntikkan ke dalam kolom yang telah diseimbangkan sebelumnya yang dioperasikan pada suhu 40°C. AA primer (derivat OPA) dipantau pada 388 nm oleh DAD sementara AA sekunder (derivat FMOC) dipantau oleh FLD, pada panjang gelombang eksitasi 266 nm dan panjang gelombang emisi 305 nm. Fase mobil A adalah 40 mM NaH2PO4 (pH 7,8 disesuaikan menggunakan larutan NaOH 10 M), sementara fase mobil B adalah asetonitril:metanol:air (45:45:10. v/v/v). Profil gradien berikut terlihat: 0–5 menit: 0% B t- 10% B; 5–25 menit: 10% B—40,5% B; 25–30 menit: 40,5% B—63% B; 30–35 menit: 63% B—82% B; 35–37 menit: 82% B—100 B; 37–39 menit: 100% B; 39–40 menit: 100% B- 0% B; 40–43 menit: 0% B. Laju aliran yang digunakan adalah 1 mL/menit.
3.2 Kunjungan dan Perilaku Serangga
Kami mencatat total 7291 menit aktivitas serangga, dengan 2671 menit di Rosh dan 4415 menit di Arad. Kami mengamati 545 kunjungan serangga ke 809 bunga. Di Rosh, kami mencatat 315 kunjungan, dengan kunjungan terbanyak oleh Apis mellifera (283 kunjungan, 89,8% dari semua kunjungan), diikuti oleh lebah soliter (24 kunjungan, 7,62%) dan lebah Eucera (8 kunjungan, 2,54%). Di Arad, kami mencatat 230 kunjungan, terutama oleh lebah Eucera (117 kunjungan, 50,9%), A. mellifera (59 kunjungan, 25,6%), lebah soliter lainnya (49 kunjungan, 21,3%), dan beberapa kunjungan Xylocopa dan hoverflies (Gambar 3A ) Dua yang terakhir tidak tercatat di Rosh. Selama kunjungan pagi, kami mengamati beberapa lebah jantan Eucera yang bermalam di bunga F. persica . Lebah di kedua populasi mencari nektar; namun, beberapa lebah mengunjungi bunga hanya untuk mengumpulkan serbuk sari. Lebah madu menunjukkan preferensi pada bunga yang baru mekar dengan serbuk sari yang melimpah. Lalat diamati hanya memakan serbuk sari. Meskipun semut terlihat mencari nektar di beberapa bunga di kedua populasi, mereka tidak dimasukkan dalam analisis karena efisiensi penyerbukannya yang relatif buruk.
Frekuensi kunjungan serangga berbeda di antara populasi yang dipelajari, dengan 1,01 ± 0,13 kunjungan/10 menit di Rosh dan 0,68 ± 0,68 di Arad (KW chi-kuadrat = 8,50, df = 1, p = 0,004; Gambar 3B ). Tidak ada perbedaan dalam durasi rata-rata kunjungan antara lokasi yang dipelajari (15,8 s ± 1,22 dan 15,6 s ± 1,28 di Rosh dan Arad, masing-masing; KW chi-kuadrat = 0,40, df = 1, p = 0,53). Kami tidak menemukan perbedaan dalam distribusi morfogroup serangga dalam frekuensi kunjungan mereka di antara populasi (Gambar 3C ; KW chi-kuadrat = 347, df = 1, p > 0,05). Di Arad, di mana populasi didominasi oleh morf gelap tetapi dengan beberapa spesimen dengan bunga yang lebih terang, kami menemukan frekuensi kunjungan yang berbeda: 0,80 ± 0,13 kunjungan/10 menit untuk morf gelap dan 0,09 ± 0,03 kunjungan/10 menit untuk morf terang (KW chi-kuadrat = 6,72, df = 1, p = 0,009). Semua kunjungan yang tercatat dalam morf terang dilakukan oleh lebah betina Eucera .
3.3 Sistem Pemuliaan
Pengukuran pembentukan buah dan biji hanya mungkin dilakukan di Rosh. Di Arad, tanaman dihancurkan oleh penggembala lokal sebelum buahnya matang. Dari 129 bunga yang disurvei, kami mengumpulkan total 57 buah, yang berisi 3523 biji. Dari 35 bunga yang diserbuki secara suplementer, 25 menghasilkan buah dan menghasilkan biji, dengan rata-rata 63,9 ± 7,42 biji per buah. Hanya 3 dari 30 bunga yang menyerbuk sendiri menghasilkan buah, dengan sangat sedikit biji di masing-masing (rata-rata 2,73 ± 23,3; 27 buah yang tidak berkembang). Hanya satu dari 29 bunga dalam autogami spontan menghasilkan buah (59 biji; 28 buah yang tidak berkembang). Pada bunga kontrol, 28 dari 35 bunga menghasilkan buah, dengan rata-rata 63,7 ± 6,91 biji. Tidak terdapat perbedaan antara jumlah biji pada bunga kontrol dan bunga yang diserbuki secara suplemen ( F (3) = 0,92; p > 0,05). Kami tidak mendeteksi adanya keterbatasan serbuk sari, dengan rata-rata PLI = −0,16 dan keterbatasan penyerbuk dengan POLI = −0,12.
3.4 Manipulasi Eksperimental Akses terhadap Nektar
Selama berlangsungnya proyek, kami mencatat 72 serangga yang berkunjung, yang secara keseluruhan menghabiskan waktu 2021 menit pada bunga percobaan (1124 menit pada Rosh 897 dan menit di Arad). Hanya A. mellifera yang tercatat pada tanaman percobaan di Rosh, sementara hanya lebah Eucera (betina) yang diamati di Arad. Tidak ada perbedaan dalam durasi kunjungan antara bunga percobaan dan bunga kontrol di lokasi yang diteliti. Pada Rosh, durasi rata-rata pada bunga eksperimen dan kontrol masing-masing adalah 15,5 ± 1,15 dan 12,8 ± 1,66 (KW chi-kuadrat = 0,32, df = 1, p = 0,57), sementara pada Arad, durasi rata-rata pada bunga eksperimen dan kontrol masing-masing adalah 10,8 ± 1,24 dan 16,0 ± 1,30 (KW chi-kuadrat = 0,10, df = 1, p = 0,75; Gambar 4A ). Pada kedua populasi, penetrasi inflorescence (jumlah bunga yang dikunjungi selama satu kunjungan dibagi dengan jumlah bunga dalam inflorescence) lebih tinggi pada bunga eksperimen (Gambar 4B ). Di Rosh, penetrasi rata-rata pada bunga percobaan dan kontrol masing-masing adalah 2,75 ± 0,46 dan 0,23 ± 0,04 (KW chi-kuadrat = 69,2, df = 1, p < 0,01), sementara di Arad, penetrasi rata-rata pada bunga percobaan dan kontrol masing-masing adalah 1,65 ± 0,28 dan 0,15 ± 0,02 (KW chi-kuadrat = 33,1, df = 1, p < 0,01). Kami mengumpulkan semua buah dari 46 bunga percobaan, di mana kami menemukan 3684 biji. Dari 46 bunga percobaan, 44 menghasilkan biji (dua buah tidak ditemukan), dengan rata-rata 80,1 ± 4,71 biji. Jumlah biji yang dihasilkan pada bunga percobaan lebih banyak dibandingkan dengan bunga kontrol (51,0 ± 41,6, KW chi-kuadrat = 11,3; df = 1, p < 0,001, Gambar 4C ).
4 Diskusi
Adaptasi terhadap preferensi penyerbuk sering digambarkan sebagai kekuatan pendorong evolusi variasi sifat bunga, khususnya terkait sifat nektar. Penelitian ini mengeksplorasi perbedaan sifat penghargaan dari dua morf warna F. persica. dan interaksinya dengan penyerbuk. Konsentrasi dan profil gula nektar secara umum konstan dalam populasi yang diteliti; namun, kami mencatat perbedaan hanya dalam volume nektar dan konsentrasi AAs. Hasil ini menunjukkan bahwa variasi yang diamati dalam produksi nektar mungkin disebabkan oleh faktor lingkungan, bukan perbedaan genetik antar tanaman. Perbedaan antara Rosh dan Arad bukanlah konsekuensi dari adaptasi lokal terhadap komunitas penyerbuk yang berbeda, karena keduanya tetap serupa secara kualitatif, dengan semua morfogrup utama hadir dalam kedua populasi penelitian, meskipun kontribusinya bervariasi. Dalam menafsirkan temuan ini, penting untuk mengenali keterbatasan yang terkait dengan ukuran sampel penelitian kami yang kecil dan tidak adanya replikasi populasi. Variasi yang diamati dalam produksi nektar dan konsistensi dalam kumpulan pengunjung di seluruh populasi memberikan wawasan yang berharga, tetapi ukuran sampel yang terbatas membatasi generalisasi hasil yang diperoleh. Selain itu, karena kami tidak menggunakan kebun umum atau percobaan untuk memisahkan plastik dari perbedaan genetik antara populasi, kami tidak dapat mengesampingkan perbedaan genetik yang ada sebagai akibat dari pergeseran acak atau adaptasi terhadap faktor lingkungan.
Dengan memanipulasi bagian-bagian bunga, kami menunjukkan bahwa mengungkap nektari yang tersembunyi tidak memengaruhi waktu yang dihabiskan di dalam bunga; namun, pada perbungaan yang dimanipulasi, penyerbuk mengunjungi lebih banyak bunga. Jadi, dengan mempelajari sifat-sifat penghargaan dan interaksi tanaman-penyerbuk dari dua bentuk warna, kami dapat menyimpulkan beberapa pendorong evolusi fitur bunga di F. persica .
4.1 Sifat Nektar
Studi kami menunjukkan bahwa bunga F. persica menghasilkan nektar yang kaya heksosa, konsisten dengan studi sebelumnya yang dilakukan dalam budidaya. Hal ini menunjukkan bahwa F. persica adalah spesies yang diserbuki serangga yang menghasilkan nektar yang didominasi oleh gula heksosa (Roguz et al. 2018 ). Namun, pada populasi liar, kami mengamati volume nektar yang lebih tinggi (hingga satu orde besaran di Rosh), ditambah dengan konsentrasi gula yang jauh lebih rendah, sementara komposisi gula nektar tetap mirip dengan studi sebelumnya (Roguz et al. 2018). ).
Glutamin, alanin, glisin, dan lisin adalah AA paling melimpah yang ditemukan dalam populasi yang diteliti, dengan dua yang pertama termasuk di antara AA paling umum yang ditemukan dalam nektar (Baker dan Baker 1975 ; Erhardt dan Rusterholz 1998 ). Glisin dan lisin juga dikenal dapat meningkatkan pertumbuhan serangga (Dadd 1973 ). Anehnya, kami mengamati prolin dalam jumlah rendah, meskipun kemunculannya umum dalam nektar banyak spesies tanaman dan sangat penting bagi penyerbuk Hymenoptera, karena ia memfasilitasi produksi ATP yang cepat dan memicu fase awal penerbangan (Carter et al. 2006 ; Micheu et al. 2000 ). Kehadiran sejumlah kecil atau tidak adanya prolin bukanlah hal yang tidak umum dan telah ditemukan pada spesies Fritillaria lainnya serta pada spesies eudicot lain yang diserbuki serangga, seperti Polemonium caeruleum (Ryniewicz et al. 2020). ).
Glutamin ditemukan dominan dalam nektar tanaman F. persica dari Arad. Namun, jumlah glutamin yang terdeteksi dalam populasi liar adalah orde besaran lebih rendah daripada yang dilaporkan oleh Roguz et al. ( 2021 ). Meskipun mendeteksi jumlah AA yang lebih tinggi dalam populasi liar dibandingkan dengan penelitian sebelumnya, kami mengamati komposisi AA yang berbeda dan tidak adanya AA tertentu, termasuk citrulline, arginine, β-alanine, taurine, gamma-aminobutyric acid, β-aminobutyric acid, α-aminobutyric acid, metionin, norvalin, leusin, dan prolin. Variasi dalam karakteristik nektar telah dilaporkan sebelumnya pada spesies lain, seperti Impatiens capensis (Lanza et al. 1995 ), dan dapat terjadi akibat diferensiasi geografis skala besar atau budidaya dalam kondisi kebun. Faktor-faktor seperti suhu, sinar matahari yang tersedia, air yang tersedia, dan ada tidaknya buah yang sedang berkembang dapat menyebabkan variasi karakteristik nektar (Lanza et al. 1995 ).
Kami mengamati jumlah produksi nektar yang lebih tinggi di nektari tersembunyi dari tepal luar hanya di Rosh, yang menunjukkan variasi geografis dalam produksi nektari antara nektari luar (tersembunyi) dan dalam (dapat diakses). Perbedaan yang diamati ini mungkin mencerminkan variasi dalam distribusi sel penghasil nektar di dalam bunga, dengan tepal luar berpotensi menampung kepadatan sel penghasil nektar yang lebih tinggi.
Kami hampir tidak menemukan perbedaan dalam volume dan konsentrasi nektar di antara masing-masing tanaman dalam setiap populasi, yang tidak terduga, mengingat bahwa penelitian pada spesies lain sering menunjukkan variasi yang signifikan dalam produksi nektar antar individu (misalnya, Lanza et al. 1983 ; Real dan Rathcke 1991 ). Homogenitas dalam produksi nektar tidak umum di antara tanaman karena sifat nektar, sebagai sifat fisiologis, dipengaruhi oleh kondisi tanaman dan sifat habitat (Brown et al. 2012 ; Cruden 1977 ; Gijbels et al. 2014 ; Lanza et al. 1995 ; Ryniewicz et al. 2020 ). Misalnya, penelitian pada Asclepias telah mengungkapkan bahwa produksi nektar terkait dengan sifat fisiologis seperti berat akar dan jumlah bunga dalam perbungaan (Pleasants dan Chaplin 1983 ), sementara penelitian pada Kalmia latifolia telah menunjukkan bahwa produksi nektar dikaitkan dengan frekuensi kunjungan (Real dan Rathcke 1991). ). Tidak adanya perbedaan volume dan konsentrasi nektar pada tingkat individu dalam penelitian kami menunjukkan bahwa variasi produksi nektar yang diamati antar populasi kemungkinan besar disebabkan oleh faktor lingkungan; namun, perbedaan genetik antara berbagai bentuk warna tidak dapat dikesampingkan.
Karakteristik nektar lain pada spesies yang dipelajari, yaitu konsentrasi gula dan profil gula, tetap konsisten dalam populasi di kedua lokasi. Perbedaan antara populasi dapat dikaitkan dengan perbedaan faktor lingkungan—tanaman gurun menghasilkan lebih sedikit nektar, konsisten dengan gagasan bahwa tanaman gurun mungkin menghadapi berbagai tantangan yang membatasi kemampuan mereka untuk menghasilkan nektar, seperti ketersediaan air, suhu tinggi, dan sinar matahari yang intens (Lanza et al. 1995 ). Lebih jauh lagi, konsentrasi nektar yang konsisten antara tanaman gurun dan tanaman dari lingkungan lain menunjukkan bahwa tanaman gurun mungkin mengalokasikan sumber daya mereka yang terbatas untuk menghasilkan nektar berkualitas tinggi daripada meningkatkan kuantitasnya. Alokasi strategis ini dapat memastikan bahwa nektar yang diproduksi oleh tanaman gurun tetap menarik bagi penyerbuk sebagai sumber energi, bahkan ketika tersedia dalam jumlah yang lebih rendah. Meskipun populasi bervariasi dalam tingkat variasi warna bunga, kita tidak dapat menarik kesimpulan mengenai hubungan antara warna bunga dan variasi produksi nektar dalam bunga, karena faktor-faktor ini mungkin membingungkan.
Hasil kami mengonfirmasi sifat konservatif komposisi nektar pada tingkat spesies, konsisten dengan temuan sebelumnya (Baker dan Baker 1986 ). Sementara profil AA serupa di seluruh populasi yang diteliti, perbedaan penting diamati. Secara khusus, jumlah rata-rata AA dan kuantitas hampir semua AA dalam nektar lebih tinggi pada populasi Rosh dibandingkan dengan Arad, dengan variasi AA paling melimpah di antara populasi. Perbedaan ini dapat disebabkan oleh berbagai faktor lingkungan, seperti nutrisi tanah, terutama nitrogen, yang diperlukan untuk sintesis AA pada tanaman (Brzosko et al. 2021 ; Ryniewicz et al. 2020 ). Pasokan nitrogen yang berbeda dalam populasi yang dipelajari, yang mengalami lingkungan yang kontras (hutan Mediterania yang ditanami vs. gurun), kemungkinan berkontribusi pada perbedaan yang diamati dalam komposisi AA. Perbedaan yang relatif kecil dalam profil AA antar populasi menunjukkan bahwa konsentrasi dan komposisi AA mungkin tidak terutama di bawah seleksi yang dimediasi oleh penyerbuk.
Kesamaan ini mungkin menunjukkan bahwa, dalam konteks interaksi tanaman-penyerbuk, F. persica mengadopsi strategi yang relatif generalis, yang berpotensi menarik berbagai penyerbuk. Namun, strategi ini tidak sepenuhnya terwujud karena keterbatasan dalam entomofauna lokal, yang membatasi keanekaragaman dan kelimpahan penyerbuk yang tersedia di setiap populasi. Seleksi yang dimediasi penyerbuk lebih lemah ketika pengunjung utama adalah beberapa taksa hewan (Caruso et al. 2019 ). Untuk spesies yang dikunjungi dan diserbuki oleh spektrum hewan yang luas, perbedaan spasial dalam karakteristik nektar tidak akan menghasilkan perbedaan dalam kumpulan penyerbuk dan spesialisasi lokal. Misalnya, dalam kasus Angelica sylvestris generalis , di mana populasi yang berbeda menunjukkan profil nektar dan aroma yang bervariasi dan secara efektif diserbuki oleh morfogroup penyerbuk yang berbeda, percobaan transplantasi mengungkapkan bahwa keberhasilan reproduksi tidak terkait dengan sumber tanaman percobaan dan bahwa serangga tidak menunjukkan preferensi terhadap genotipe lokal (Roguz et al. 2019 ).
4.2 Sistem Pemuliaan
Kami tidak mendeteksi adanya keterbatasan serbuk sari, karena keberhasilan reproduksi F. persica hampir identik antara bunga yang diserbuki dengan tangan dan bunga yang diserbuki terbuka. Autogami spontan sangat jarang terjadi, jika terjadi, pada bunga bagian bawah. Kami memerlukan penelitian lebih lanjut untuk menguji autogami spontan pada bunga tengah dengan tangkai dan kepala sari pada ketinggian yang sama. Bunga bagian atas sebagian besar adalah bunga jantan, yang jelas tidak dapat menghasilkan biji. Secara keseluruhan, hasil kami menunjukkan adanya beberapa tingkat ketidakcocokan diri pada F. persica . Kemampuan rendah untuk melakukan penyerbukan sendiri pada sebagian besar bunga bagian bawah pada F. persica mungkin terkait dengan perilaku penyerbuk. Pada perbungaan vertikal yang dikunjungi oleh lebah yang cenderung mencari makan ke atas, bunga paling bawah menerima serbuk sari silang sementara bunga paling atas mengekspornya ke tanaman lain (Barrett 2003 ). Selain itu, dalam kasus transfer serbuk sari yang cukup, yang menjamin keberhasilan reproduksi maksimal, tidak ada tekanan selektif yang kuat untuk mempertahankan kompatibilitas diri. Namun, dalam kasus ketidaksesuaian berulang dengan aktivitas penyerbuk, beberapa individu yang memiliki kecocokan sendiri dapat mengamankan produksi benih.
4.3 Interaksi dengan Penyerbuk
Bunga-bunga dalam populasi Arad sebagian besar dikunjungi oleh lebah liar, kebanyakan Eucera , sedangkan bunga-bunga dalam populasi Rosh hampir secara eksklusif dikunjungi oleh lebah madu. Kehadiran koloni lebah madu yang dibudidayakan mungkin telah memengaruhi sistem penyerbukan di F. persica dan interaksi tanaman-penyerbuk lokal. Sebuah studi pada Brassica rapa telah menunjukkan bahwa perubahan dalam komunitas penyerbuk dapat memiliki konsekuensi cepat pada evolusi sifat-sifat tanaman dan sistem perkawinan (Gervasi dan Schiestl 2017 ). Sementara kami tidak memiliki bukti langsung untuk perubahan tersebut di F. persica , bentuk pertumbuhan menahun dari spesies tersebut menunjukkan bahwa setiap efek dari komunitas penyerbukan yang dimodifikasi mungkin bertahap dan difasilitasi oleh interaksi dengan kondisi lingkungan. Meskipun demikian, efek dari lebah madu yang dibudidayakan pada keberhasilan reproduksi tanaman di wilayah iklim Mediterania di Israel telah ditunjukkan untuk geofit hias lainnya, seperti Iris atropurpurea (Watts et al. 2013 ). Melimpahnya lebah madu di komunitas alami dapat meningkatkan keterbatasan serbuk sari dan memenuhi peluang untuk seleksi (Trunschke et al. 2017 ). Hal ini juga dapat menjelaskan perbedaan karakteristik nektar di Rosh, dibandingkan dengan populasi Arad.
Pada populasi gurun, yang didominasi oleh individu dengan bunga gelap, kami juga mencatat penyerbuk yang berlindung di malam hari memasuki bunga sesaat sebelum senja. Warna gelap mungkin terkait dengan pengumpulan panas dengan menyerap radiasi matahari. Imbalan termal ini sebelumnya dijelaskan pada bunga yang juga menawarkan imbalan makanan (Herrera 1995 ; Totland 1996 ). Berlawanan dengan Oncocyclus irises, spesies gurun lain tempat lebah jantan soliter yang berlindung telah dijelaskan sebagai penyerbuk wajib (Sapir et al. 2005 , 2006 ), F. persica tidak bergantung pada lebah jantan yang berlindung di malam hari sebagai penyerbuk wajibnya, dan peran mereka dalam penyerbukan spesies ini mungkin marjinal. Kami mencatat beberapa Eucera yang dikelompokkan rapat bersama-sama dalam bunga sebagian besar pada akhir periode pembungaan, dengan bunga-bunga ini biasanya tidak memiliki butiran serbuk sari di kepala sari.
Populasi Arad sebagian besar terdiri dari bunga berwarna gelap, dengan frekuensi yang lebih rendah (sekitar 5% dari populasi) bunga berwarna terang. Kami telah mencatat frekuensi kunjungan yang lebih rendah untuk bunga berwarna terang. Kami berasumsi bahwa, dalam kasus spesies yang dipelajari, warna bunga mungkin bukan fitur adaptif, dan polimorfisme warna bukanlah hasil dari proses adaptif. Variasi warna dalam populasi yang diamati mungkin merupakan hasil dari proses netral atau acak (Sapir et al. 2021 ), seperti dalam kasus Iris lutescens , di mana penelitian yang menguji penyebab genetik dimorfisme warna mengungkapkan bahwa frekuensi relatif bunga kuning versus ungu dalam populasi dipengaruhi oleh pergeseran atau aliran gen, bukan faktor ekologi (Wang et al. 2014).
Polimorfis warna pada spesies atau populasi ini juga dapat menyebabkan kombinasi sifat bunga yang spesifik terhadap morf yang menarik penyerbuk dengan preferensi yang berbeda, misalnya, terhadap aroma bunga. Dalam beberapa kasus, morf bunga putih dapat melepaskan lebih banyak senyawa aroma aromatik karena mereka mewakili mutan nol dengan jalur pigmen biosintesis yang terhalang, yang dapat menyebabkan perubahan pada jenis atau jumlah senyawa volatil yang diproduksi (Majetic et al. 2007 ). Potensi agen biotik seperti penyerbuk untuk memilih kombinasi aroma–warna bunga tertentu memerlukan penelitian lebih lanjut dalam kasus F. perisca .
Warna bunga pada F. persica dapat berfungsi sebagai penyaring fenotip, yang memengaruhi interaksi dengan penyerbuk dan herbivora. Penelitian menunjukkan bahwa lalat, khususnya lalat terbang seperti Eristalis tenax , lebih menyukai bunga kuning dan putih daripada bunga ungu. Preferensi ini kemungkinan besar disebabkan oleh kepekaan visual mereka terhadap panjang gelombang kuning, yang membuat bunga kuning lebih terlihat dan menarik. Lebih jauh, dalam hal interaksi herbivora, morf merah Raphanus sativus , yang lebih kaya akan metabolit sekunder, menawarkan pertahanan yang lebih baik terhadap herbivora (Irwin et al. 2003) ).
Bunga yang bergantung pada penyerbuk bergantung pada karbohidrat impor dari daun di sekitarnya untuk produksi hadiah. Fotosintesis bunga pada kelopak hijau juga dapat berkontribusi pada kebutuhan karbon untuk reproduksi (Aschan dan Pfanz 2003 ). Selain penyerbukan, perbedaan warna bunga pada F. persica dapat dikaitkan dengan akumulasi pigmen, seperti flavonoid dan antosianin, yang dapat melindungi terhadap stres fotooksidatif, dingin, dan stres air (Chalker-Scott 1999 ). Perlindungan ini sangat menguntungkan di lingkungan dengan radiasi matahari tinggi, seperti gurun, meningkatkan umur bunga dan kualitas nektar.
Penelitian lebih lanjut yang berfokus pada efisiensi pengunjung bunga diperlukan untuk menggambarkan ekotipe penyerbukan secara lengkap. Tekanan selektif potensial yang diberikan oleh penyerbuk variabel merupakan prasyarat yang diperlukan untuk spesialisasi lokal penyerbuk yang paling penting (Gómez dan Zamora 2006 ; Zamora 2000 ; Zych et al. 2019 ).
4.4 Manipulasi Bunga Eksperimental
Bunga Fritillaria persica sebagian menyembunyikan nektar, dan penelitian kami mengungkapkan bahwa jumlah nektar tersembunyi mungkin melebihi fraksi yang terlihat—pada populasi Rosh, tepal luar menghasilkan lebih banyak nektar. Pencatatan perilaku penyerbuk di dalam bunga menunjukkan bahwa lebah, seperti lebah madu, mampu mendeteksi imbalan dari nektar tersembunyi. Kunjungan mereka serupa dalam durasi antara bunga kontrol dan bunga eksperimen, di mana nektarnya tidak tertutup. Namun, perbedaan diamati dalam jumlah bunga yang dikunjungi selama satu kali—pada kedua populasi yang diteliti, penyerbuk mengunjungi lebih banyak bunga di dalam perbungaan ketika nektar bunga di bagian bawah tidak tertutup.
Dengan mempertimbangkan jumlah bunga yang lebih banyak yang dikunjungi dalam satu inflorescence, keberhasilan reproduksi yang lebih tinggi yang tercatat pada bunga dengan nektar yang tidak tertutup, jika dibandingkan dengan bunga kontrol, mungkin mengejutkan. Kami berhipotesis bahwa efek positif pada produksi benih ini mungkin terkait dengan potensi perubahan perilaku penyerbuk pada bunga yang dimodifikasi secara eksperimental. Pada bunga dengan semua nektar yang tersedia, penyerbuk mungkin bergerak lebih sedikit saat mencari makan (karena akses ke hadiah lebih mudah) sehingga menyimpan lebih sedikit butiran serbuk sari mereka sendiri pada stigma. Pada spesies yang sebagian tidak kompatibel dengan diri sendiri, yang mungkin merupakan kasus F. persica , mengunjungi lebih banyak bunga dalam satu inflorescence atau menyimpan lebih banyak serbuk sari mereka sendiri saat mencari makan dapat mengakibatkan tingkat geitonogami yang tinggi dan mengurangi keberhasilan reproduksi (Webb dan Lloyd 1986 ). Oleh karena itu, hadiah yang sebagian tersembunyi dapat mencegah pengunjung bunga mengunjungi lebih banyak bunga dalam satu inflorescence.
Dalam konteks ekologi, keberadaan nektar tersembunyi dapat berfungsi sebagai strategi untuk melindungi makanan dari pencuri nektar, yang mengonsumsi nektar tanpa menyediakan layanan penyerbukan apa pun bagi tanaman, seperti semut, yang diamati pada bunga spesies yang diteliti. Selain itu, kami berasumsi bahwa peran hadiah tersembunyi dalam kasus F. persica mungkin juga mempertahankan daya tarik bunga dalam jangka waktu yang lebih lama. Karena jumlah nektar di tepal tersembunyi luar terakumulasi selama antesis, nektar tersebut secara bertahap mengalir ke nektar yang terlihat di bagian dalam, memperpanjang periode daya tarik bagi penyerbuk dan meningkatkan kemungkinan kunjungan lebih banyak penyerbuk.
5 Kesimpulan
Menentukan faktor pendorong variasi spasial dalam populasi alami sangat penting untuk memahami proses diferensiasi adaptif dan keanekaragaman tumbuhan berbunga. Studi kami mendokumentasikan variasi geografis dalam interaksi tumbuhan-penyerbuk dari dua populasi, yang berbeda dalam warna bunganya. Hal ini menunjukkan bahwa populasi yang disurvei mungkin mewakili ekotipe penyerbukan yang berbeda. Kumpulan pengunjung yang tercatat di kedua populasi tetap serupa secara kualitatif, dengan semua morfogrup utama hadir di kedua populasi studi, tetapi kontribusinya bervariasi. Sifat imbalan juga serupa di antara populasi yang dipelajari—konsentrasi dan komposisi nektar hampir sama di antara populasi yang dipelajari. Kesamaan ini mungkin menunjukkan bahwa dalam konteks interaksi tumbuhan-penyerbuk, F. persica merupakan strategi yang agak umum. Imbalan, meskipun sebagian tersembunyi, tersedia bagi penyerbuk dan dapat memperluas daya tarik bunga bagi penyerbuk potensial. Dengan memanipulasi bagian-bagian bunga, kami menunjukkan bahwa mengungkap nektari yang tersembunyi tidak memengaruhi waktu yang dihabiskan di dalam bunga; namun, dalam perbungaan yang dimanipulasi, penyerbuk mengunjungi lebih banyak bunga. Secara keseluruhan, pengamatan kami menyoroti pentingnya mempelajari interaksi tanaman-penyerbuk secara terperinci, karena interaksi tersebut dapat mengungkap aspek-aspek penting dan sebelumnya tidak diketahui dari biologi dan ekologi tanaman. Penelitian lebih lanjut yang menguji tekanan selektif yang diberikan oleh kumpulan penyerbuk lokal diperlukan untuk mengungkap arah potensial evolusi spesies.
