ABSTRAK
Ada dua subform utama dari ikan teleost Tetra Meksiko ( Astyanax mexicanus ): ikan permukaan yang hidup di sungai dan ikan gua buta yang hidup di gua. Baru-baru ini, spesies ini telah menjadi model hewan yang populer dalam penelitian biologi perkembangan. Dilaporkan bahwa ikan gua memiliki lebih banyak gigi daripada ikan permukaan; namun, deskripsi terperinci tentang perkembangan dan penggantian gigi oral pada tetra Meksiko masih belum tersedia. Dalam penelitian ini, kami menyelidiki perbedaan jumlah gigi antara ikan permukaan dan ikan gua dengan mengkarakterisasi fitur gigi mandibula pada tetra Meksiko dewasa dan mengeksplorasi proses perkembangan gigi generasi pertama pada ikan larva. Mengenai perkembangan gigi awal, larva ikan permukaan dan ikan gua Pachón pada 12, 18, 21, 24, dan 30 hari pasca-fertilisasi di-eutanasia. Pewarnaan hematoksilin dan eosin dilakukan untuk analisis histologis, dan imunohistokimia digunakan untuk mendeteksi ekspresi penanda odontogenik Sox2. Hasilnya menunjukkan bahwa ikan tetra Meksiko mengganti gigi fungsional melalui lamina gigi suksesi yang ditandai dengan ekspresi Sox2. Ikan gua Pachón dewasa memiliki lebih banyak gigi pengganti intraoseus. Perkembangan gigi mandibula pada ikan larva juga ditandai dengan ekspresi Sox2, dan tidak ada bukti yang mendukung perkembangan gigi dalam lamina gigi berkelanjutan. Temuan kami menggambarkan munculnya lamina gigi suksesi pada penggantian gigi pada ikan tetra Meksiko tetapi tidak memberikan bukti mengenai lamina gigi berkelanjutan. Pada ikan tetra Meksiko, gigi dari gigi generasi pertama dapat berkembang secara independen. Hasil dari proyek ini akan menawarkan informasi histologis yang berharga untuk penelitian masa depan tentang perkembangan gigi pada ikan tetra Meksiko.
1 Pendahuluan
Tetra Meksiko ( Astyanax mexicanus ) adalah spesies ikan teleost yang termasuk dalam ordo Characiforms. Ada dua subtipe morfologi utama tetra Meksiko: bentuk yang dapat melihat, yang hidup di air permukaan, yang dikenal sebagai ikan permukaan; dan bentuk yang buta, tidak berpigmen, yang hidup di air gua, yang dikenal sebagai ikan gua (Atukorala et al. 2013 ). Divergensi kedua subbentuk tersebut diyakini sebagai hasil dari proses evolusi di mana sekawanan ikan, setelah secara tidak sengaja memasuki gua, terperangkap dan terisolasi di sana, akhirnya berevolusi menjadi bentuk yang hidup di gua (Perera et al. 2023 ). Selama bertahun-tahun, tetra Meksiko telah menjadi model hewan yang sangat baik untuk studi evolusi dan perkembangan. Pertama, ia menyediakan elemen khusus untuk penelitian evolusi. Sekitar 29 bentuk ikan gua telah ditemukan di berbagai gua, tempat mereka beradaptasi dan berkembang biak dalam kondisi troglomorfik (Bradic et al. 2012 ). Berbagai faktor, seperti sumber makanan, cahaya, suhu, dan pH, telah mendorong evolusi sifat-sifat serupa di antara bentuk-bentuk ikan gua (Perera et al. 2023 ). Kedua, tetra Meksiko adalah model hewan yang berharga dalam studi perkembangan (Jeffery 2001 ). Bentuk-bentuk ikan gua dan ikan permukaan adalah spesies yang sama dan sepenuhnya dapat saling kawin, yang memungkinkan para peneliti untuk menganalisis dasar-dasar genetik sifat-sifat dengan menyilangkan ikan gua dan ikan permukaan. Selain itu, tetra Meksiko menghasilkan telur yang transparan, yang memfasilitasi visualisasi perkembangan internal (Atukorala et al. 2019 ). Akhirnya, bentuk ikan gua dari tetra Meksiko menunjukkan sifat-sifat yang menarik, termasuk hilangnya pigmen, pengurangan ukuran mata, peningkatan organ sensorik non-optik, berkurangnya tidur, dan peningkatan jumlah gigi, yang menjadikan tetra Meksiko model yang berharga dalam berbagai penelitian (Bradic et al. 2012 ).
Gigi, seperti organ ektodermal lainnya seperti folikel rambut dan kelenjar, berkembang melalui pensinyalan sel resiprokal antara epitel khusus dan ektomesenkim yang berdekatan, yang berasal dari bagian kranial populasi sel krista saraf. Pada tikus, sel krista saraf mulai bermigrasi sekitar E8, dan pada E9.5, mereka tiba di area dugaan tempat gigi berkembang (Phillips et al. 2012 ). Perkembangan gigi tunggal melibatkan beberapa tahap: inisiasi, plakoda, kuncup, tutup, lonceng, dan pematangan akhir. Deretan gigi yang sejajar di sepanjang tulang alveolar tulang rahang atas dan tulang rahang bawah membentuk gigi. Pembentukan gigi adalah area menarik yang memerlukan studi lebih lanjut. Bahasa Indonesia: Pada tahun 2017, Juuri dan Balic, dengan mengamati potongan histologis pada musang, secara formal mendeskripsikan perkembangan gigi melalui lamina gigi yang berkesinambungan, tempat gigi inisiator berkembang, dan lamina giginya bermigrasi ke arah distal, sehingga menghasilkan gigi dari kelas yang sama (Juuri dan Balic 2017 ). Telah dilaporkan bahwa pada tikus, molar ditambahkan ke posterior secara seri, meskipun dalam beberapa penelitian, molar kedua diamati berkembang dari epitel gigi yang terinvaginasi secara lokal (Gaete et al. 2015 ; Ko et al. 2021 ; Jussila et al. 2014 ; Juuri et al. 2013 ). Singkatnya, gigi dari kelas yang sama dapat berkembang dari plakoda gigi yang sama, yang pada akhirnya berkontribusi pada pembentukan gigi pada mamalia. Proses penggantian gigi atau gigi merupakan bidang penelitian penting lainnya. Ada tiga metode penggantian yang telah diidentifikasi. Pertama, gigi baru berkembang langsung dari bagian paling distal gigi yang ada, seperti yang terlihat pada manatee, di mana molar pengganti dihasilkan secara berurutan dan bergerak maju untuk menggantikan gigi yang ada (Woodard 2020 ). Kedua, gigi pengganti baru berkembang di lingual pendahulunya de novo , seperti yang dijelaskan pada salmon Atlantik ( Salmo salar L. ) dan bichir Afrika ( Polypterus senegalus ) (Huysseune dan Witten 2008 ). Metode terakhir melibatkan penggantian gigi atau lamina gigi suksesi. Seperti lamina gigi kontinu, lamina gigi suksesi berkembang dari benih gigi dari benih gigi pendahulu. Lamina gigi di sisi lingual benih gigi ini juga berinvaginasi ke dalam mesenkim dan berkembang menjadi gigi baru yang menggantikan pendahulunya (Järvinen et al. 2009 ). Baik lamina gigi kontinu maupun lamina gigi suksesi ditandai oleh ekspresi SOX2, yang menunjukkan adanya hubungan intrinsik potensial antara proses perkembangan gigi dan penggantian gigi (Juuri dan Balic 2017 ).
Bahasa Indonesia: Sebagai polifiodonta, ikan tetra Meksiko mengganti gigi mereka sekitar 40 kali sepanjang masa hidup mereka (Trapani et al. 2005 ). Tetra Meksiko memiliki gigi faring dan gigi mulut, dengan gigi mulut yang terdiri dari gigi pada premaksila, maksila, dan mandibula (Atukorala et al. 2013 ). Generasi pertama gigi mulut mulai berkembang sekitar 4 hari pasca-fertilisasi (dpf), ditandai dengan erupsi gigi pertama (Trapani et al. 2005 ). Gigi ditambahkan secara rostral pada premaksila dan secara kaudal pada mandibula ke gigi pertama. Pada 21 dpf, delapan gigi telah erupsi pada mandibula secara unilateral, dan perkembangan gigi pertama umumnya selesai sekitar 25–30 dpf (Atukorala dan Franz-Odendaal 2014 ). Namun, studi histologis tentang perkembangan gigi awal tetra Meksiko masih terbatas. Menggambarkan pola perkembangan gigi dari dua subbentuk tetra Meksiko, ikan permukaan dan ikan gua, akan membantu menjelaskan mekanisme pengaturan jumlah gigi. Pertama, penelitian sebelumnya telah melaporkan bahwa ikan gua memiliki lebih banyak gigi oral daripada ikan permukaan, meskipun mereka dianggap sebagai spesies tunggal (Atukorala dan Franz-Odendaal 2014 ), yang menjadikan tetra Meksiko model hewan yang ideal untuk penelitian jumlah gigi. Kedua, hibrida F1 dari ikan permukaan dan ikan gua tampaknya memiliki jumlah gigi menengah, menunjukkan mekanisme kuantitatif pengaturan jumlah gigi pada tetra Meksiko (Atukorala et al. 2013 ). Akhirnya, dengan membandingkan persamaan dan perbedaan dalam perkembangan gigi antara dua subbentuk, faktor histologis atau genetik utama yang menyebabkan perbedaan jumlah gigi dapat diidentifikasi. Oleh karena itu, diperlukan penelitian lebih lanjut yang mendalam.
Penelitian ini membahas dua tujuan utama. Tujuan pertama adalah untuk mengkarakterisasi ciri-ciri gigi mandibula pada ikan permukaan dewasa dan ikan gua Pachón dan membandingkan kedua bentuk tersebut. Tujuan kedua adalah untuk mendeskripsikan perkembangan gigi pertama pada mandibula larva ikan permukaan dan ikan gua.
2 Bahan dan Metode
2.1 Bahan
Ikan permukaan tetra Meksiko ( A. mexicanus ) dan ikan gua Pachón ditempatkan pada siklus siang/malam 12 jam/12 jam pada suhu 21°C di koloni sistem rak Tecniplast atau tangki ikan mandiri di University of Manitoba. Konduktivitas air sistem diatur pada 900 μS, dan pH diatur pada 7,2. Secara teratur, ikan tetra Meksiko dewasa (lebih dari 6 bulan pasca-fertilisasi [mpf]) diberi makan dua kali sehari dengan makanan serpihan (Tetramin).
Untuk menyiapkan tangki pembiakan, suhu air diatur ke 26°C, dan ikan tetra Meksiko dewasa jantan dan betina dimasukkan ke dalam tangki yang baru disiapkan. Dalam 3 hari berikutnya, telur yang diletakkan diperiksa dan dikumpulkan antara pukul 10 pagi dan 12 siang. Setelah dicuci dengan media embrio, telur diinkubasi pada suhu 26°C. Ikan larva diberi makan udang air asin hidup ( Artemia franciscana ) dan secara bertahap dipindahkan ke wadah yang lebih besar sebelum 30 dpf. Selanjutnya, ikan muda (1–6 mpf) dibesarkan di tangki sistem biasa. Semua penelitian hewan dilakukan dalam kondisi standar dan sesuai dengan pedoman Dewan Perawatan Hewan Kanada. Semua protokol ditinjau dan disetujui oleh layanan perawatan hewan pusat Universitas Manitoba.
2.2 Pewarnaan Tulang Alizarin Merah (Seluruh Gunung)
Ikan tetra Meksiko dewasa dan ikan gua Pachón dieutanasia dengan larutan 0,1% Tricaine methanesulphonate (MS222) (Nomor Cat. 118000500; Fisher Chemicals) dan difiksasi dengan larutan paraformaldehida 4% semalaman. Setelah dicuci dengan garam penyangga fosfat (PBS), sampel dipindahkan ke 70% EtOH (Nomor Cat. HC-600-1GAL; Fisherbrand) pada suhu ruangan selama 30 menit dan kemudian diputihkan dengan larutan kalium hidroksida 1% dan hidrogen peroksida 3% semalaman. Setelah itu, sampel dicuci dan direndam dalam larutan boraks jenuh (Nomor Cat. B9876; Sigma-Aldrich) semalaman. Selanjutnya, sampel diwarnai dengan larutan pewarna merah alizarin (Alizarin red S [Nomor Cat. A5533; Sigma-Aldrich] dalam larutan KOH 1%) semalaman dan dicerna dalam larutan tripsin boraks selama tiga malam. Semua sampel diproses melalui serangkaian gradien dari 20% gliserol dalam KOH 1% hingga 100% gliserol dan disimpan pada suhu ruangan. Untuk menentukan jumlah gigi, mandibula dibedah secara manual dengan hati-hati di bawah mikroskop stereo. Rahang bawah diperiksa di bawah mikroskop stereo Zeiss discovery V8 (Zeiss, Jerman), dan jumlah gigi yang erupsi di setiap sisi dihitung secara manual.
2.3 Histologi
Ikan permukaan tetra Meksiko dewasa dan ikan gua Pachón dipenggal, dan mandibulanya diisolasi. Sampel kemudian didekalsifikasi selama 1 minggu dalam larutan asam etilendiamintetraasetat 10% (Nomor Cat. BDH4616-500G; VWR Chemicals BDH). Dalam percobaan dengan larva tetra Meksiko, beberapa modifikasi dilakukan pada protokol pada usia 6, 9, 12, 18, 21, 24, dan 30 dpf. Tidak ada dekalsifikasi yang dilakukan pada sampel ikan pada usia 6 dan 9 dpf. Sampel ikan didekalsifikasi selama 3 hari pada kelompok 12, 18, dan 21 dpf, dan 4 hari pada kelompok 24 dan 30 dpf. Untuk pemrosesan jaringan, sampel didehidrasi dalam serangkaian larutan EtOH bertingkat, dibersihkan dalam xilena (Nomor Cat. X5-1; Fisher Chemical) dan akhirnya diinfiltrasi dengan parafin cair pada suhu 60°C. Jaringan dibenamkan dalam parafin, dan pemotongan mikrotom dilakukan hingga ketebalan 10 μm. Kaca objek diwarnai dengan hematoksilin dan eosin sesuai dengan protokol standar.
Untuk imunohistokimia, irisan parafin dideparafinisasi, direhidrasi, dan diinkubasi dalam buffer natrium sitrat 10 mM pada suhu 60°C semalaman untuk pengambilan antigen. Kemudian, slide diproses menggunakan Mouse and Rabbit Specific HRP/DAB Detection IHC Kit (ab64264; Abcam) sesuai dengan petunjuk pabrik pembuatnya. Antibodi Poliklonal SOX2 (1:800, No. Katalog PA1-094; Invitrogen) digunakan sebagai antibodi primer.
2.4 Pencitraan dan Analisis
Gambar sampel seluruh bagian yang diwarnai dengan alizarin merah diambil dengan perangkat lunak ZEN 3.4 (edisi biru, Zeiss). Untuk bagian yang diwarnai dengan hematoksilin dan eosin dan bagian yang diproses untuk IHC, gambar mikroskop diambil menggunakan Kepala Kamera Warna Definisi Tinggi DS-Fi2 dan Unit Kontrol Kamera Mandiri DS-L3 (Nikon, Jepang). Gambar diproses untuk mendapatkan kualitas gambar yang lebih baik.
Gigi diberi label sesuai dengan protokol berikut: Dimulai dari garis tengah mandibula, gigi yang tersusun searah jarum jam dianggap sebagai gigi sisi kanan, sedangkan gigi yang tersusun berlawanan arah jarum jam dianggap sebagai gigi sisi kiri. Di setiap kuadran, gigi fungsional yang paling dekat dengan garis tengah diberi label sebagai t(1), diikuti oleh t(2), t(3) … t( n ). Selain itu, gigi pengganti atau benih gigi untuk pendahulunya t(n) diberi label sebagai t( n , r ). Untuk analisis statistik, perangkat lunak GraphPad Prism digunakan untuk menganalisis data kelompok. Uji- t digunakan untuk menentukan perbedaan yang signifikan, dan nilai- p kurang dari 0,05 dianggap signifikan secara statistik secara default.
3 Hasil
3.1 Ikan Gua Tetra Meksiko Memiliki Lebih Banyak Gigi di Rahangnya
Pewarnaan alizarin red whole-mount dilakukan pada ikan permukaan tetra Meksiko dewasa dan ikan gua Pachón. Tampak punggung dan tampak punggung lateral rahang bawah yang diwarnai dicitrakan (Gambar 1B–F ). Gigi pengganti yang sedang berkembang disusun dalam satu baris di mandibula. Satu baris gigi membentuk gigi mandibula yang sejajar di sepanjang rahang bawah. Gigi rostral lebih besar dan multikuspid, sedangkan gigi kaudal kecil dan unikuspid pada ikan permukaan dan ikan gua Pachón. Dentin gigi dan mandibula diwarnai merah tua, dan enameloid diwarnai merah muda.
Gigi dihitung pada setiap sisi mandibula (Gambar 1G ). Rata-rata, ikan permukaan memiliki 5 gigi secara unilateral, dan ikan gua Pachón memiliki 8,75 gigi, yang secara signifikan lebih tinggi dari yang dilaporkan sebelumnya. Perbandingan jumlah gigi multicuspid menghasilkan hasil yang sama (Gambar 1H ). Selain perbedaan dalam jumlah gigi, ikan gua Pachón dan ikan permukaan menunjukkan pola jenis gigi yang berbeda. Meskipun penurunan bertahap dalam ukuran gigi ke arah posterior gigi diamati pada kedua subform, ada penurunan ukuran yang signifikan secara tiba-tiba pada gigi keempat atau kelima pada ikan permukaan, sedangkan kurva penurunan ukuran gigi pada ikan gua Pachón lebih halus.
3.2 Gigi Tetra Meksiko Dewasa Diganti melalui Lamina Gigi Suksesi yang Ditandai dengan Ekspresi Sox2
Mandibula ikan permukaan tetra Meksiko yang dikorbankan dan ikan gua Pachón dibedah untuk membuat irisan melintang serial. Dari bagian dorsal ke bagian ventral mandibula, irisan dapat dibagi menjadi tiga lapisan utama: lapisan paling superfisial, lapisan tengah, dan lapisan dalam. Pada lapisan paling superfisial, gigi fungsional sejajar secara simetris di sepanjang rahang bawah, dan ukurannya menurun secara progresif (Gambar 2A,B ). Struktur invaginasi, mirip dengan sulkus vestibulum mamalia tetapi bentuknya lebih tidak teratur, terlihat di labial gigi fungsional rostral. Dentin dan pulpa terlihat di setiap gigi. Di rongga pulpa, berdekatan dengan dentin, terdapat lapisan odontoblas, yang memisahkan jaringan pulpa dan dentin. Di lingual gigi fungsional, terdapat pita tipis penebalan epitel. Di lapisan tengah mandibula, irisan berisi set gigi fungsional pertama dan pendahulunya (Gambar 2C,D ). Gigi pengganti yang sedang berkembang diposisikan di lingual ke gigi pendahulunya, dan setiap gigi fungsional berhubungan dengan satu gigi pengganti. Gigi dan tulang fungsional secara anatomis dekat, dengan gigi kemungkinan menyatu dengan jaringan tulang dan berlabuh. Remodelasi tulang terjadi antara gigi fungsional dan gigi pengganti. Di lapisan dalam, hanya ada gigi pengganti (Gambar 2E,F ). Mempertimbangkan morfologi benih gigi, sebagian besar gigi kemungkinan berada pada tahap lonceng akhir. Gigi pengganti rostral dienkapsulasi oleh jaringan tulang secara lingual dan labial. Secara keseluruhan, tidak ada perbedaan histologis yang signifikan yang diamati pada gigi fungsional pada ikan permukaan tetra Meksiko dewasa dan ikan gua. Gigi fungsional pada ikan permukaan tampak lebih besar pada penampang melintang (tidak ditunjukkan dalam gambar). Namun, dengan mempertimbangkan potensi deformasi buatan selama pemrosesan histologis, perbandingan statistik tidak dilakukan.
Untuk bagian penggantian gigi dari penelitian ini, lamina gigi suksesi hadir di ikan permukaan tetra Meksiko dewasa dan ikan gua Pachón (Gambar 3 ). Pada lapisan superfisial, lamina gigi suksesi berasal dari epitel yang menebal di lingual gigi yang berfungsi (Gambar 3A,I ). Invaginasi ke arah ventral, ia berubah dari bentuk pita menjadi bentuk seperti pita di penampang melintang (Gambar 3B,J ). Setelah mencapai sekitar lapisan tengah, lamina gigi suksesi membentuk benih gigi, baik yang bersentuhan langsung dengan atau dihubungkan oleh jaringan epitel (Gambar 3C,D,K,L ). Akhirnya, penampang melintang benih gigi membesar, membentuk struktur gigi yang sedang berkembang. Ada karakteristik histologis yang serupa pada ikan permukaan dan ikan gua (Gambar 3A–E,I–M ).
Pada beberapa reptil, ikan, dan mamalia, ada laporan bahwa SOX2 berfungsi sebagai penanda lamina gigi suksesi (Kim et al. 2020 ). Namun, peran Sox2 selama odontogenesis pada tetra Meksiko masih belum diketahui. Imunohistokimia mengungkapkan lokalisasi ekspresi Sox2 pada tetra Meksiko dalam penelitian ini. Pada lapisan superfisial, Sox2 diekspresikan dalam epitel yang menebal pada sisi lingual gigi fungsional dan diekspresikan dalam odontoblas di dalam rongga pulpa (Gambar 4E,F,K,L ). Pada irisan serial lapisan tengah, ekspresi Sox2 secara spesifik menguraikan morfologi lamina gigi suksesi (Gambar 4F–J,L–P ). Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa pada ikan permukaan tetra Meksiko dewasa dan ikan gua Pachón, gigi fungsional digantikan oleh gigi pengganti yang dibentuk oleh lamina gigi suksesi yang ditandai oleh ekspresi Sox2.
3.3 Lebih Banyak Gigi Mandibula Diganti Secara Intraoseus pada Ikan Gua Pachón
Studi ini mempertimbangkan penggantian gigi intraoseus ketika benih gigi pengganti berkembang dengan tulang yang tertutup di bagian lingual, sedangkan pada penggantian gigi ekstraoseus, tidak ada jaringan tulang pada sisi lingual benih gigi pengganti yang sedang berkembang. Studi saat ini lebih lanjut mengeksplorasi faktor histologis yang terkait dengan perbedaan jumlah gigi antara dua subbentuk tetra Meksiko. Penelitian sebelumnya telah melaporkan bahwa ada dua tren simultan selama odontogenesis pada tetra Meksiko: peralihan dari penggantian gigi ekstraoseus ke penggantian gigi intraoseus; dan peralihan dari penggantian gigi unikuspid ke penggantian gigi multikuspid (Trapani et al. 2005 ; Huysseune dan Witten 2024 ). Mempertimbangkan bahwa ada lebih banyak gigi dan gigi multikuspid pada ikan gua Pachón, penyelidikan tentang perbedaan penggantian gigi intraoseus antara ikan gua Pachón dewasa dan ikan permukaan diperlukan.
Semua gigi rostral menunjukkan penggantian gigi intraoseus pada ikan permukaan tetra Meksiko dewasa dan ikan gua. Di daerah paling kaudal, dua subform menunjukkan penggantian gigi ekstraoseus (Gambar 5 dan 6 ). Potongan serial menunjukkan titik batas tempat mandibula bercabang menjadi tulang labial dan lingual yang mengelilingi benih gigi pengganti yang sedang berkembang. Di anterior titik ini, gigi diganti secara intraoseus, sedangkan gigi posteriornya dalam penggantian ekstraoseus. Gigi pengganti intraoseus dalam dua subform dihitung. Ada lebih banyak gigi pengganti intraoseus pada ikan gua Pachón daripada pada ikan permukaan (Gambar 6I ), dan proporsi gigi pengganti intraoseus lebih besar pada ikan gua Pachón daripada pada ikan permukaan (Gambar 6J ).
3.4 Larva Ikan Tetra Meksiko Menunjukkan Gigi Pertama yang Kompleks
Studi ini juga menyelidiki perkembangan gigi primer di tetra Meksiko. Bentuk permukaan tetra Meksiko dipilih sebagai model hewan untuk mengeksplorasi secara awal manifestasi histologis perkembangan gigi awal di tetra Meksiko dan digunakan sebagai referensi. Potongan mandibula ikan permukaan 9, 12, 18, 21, 24, dan 30 dpf diwarnai dan dianalisis. Pada 9 dpf, beberapa gigi seperti dentikel miring ke lingual. Gigi-gigi ini terkait erat dengan epitel oral dan menunjukkan mineralisasi terbatas. Benih gigi tidak dapat dikonfirmasi pada tahap lonceng atau tutup, juga tidak ada bukti lamina gigi kontinu yang khas. Gigi-gigi ini kemungkinan terbentuk langsung dari epitel. Di sisi lingual gigi fungsional, ada kelompok sel yang berasal dari epitel, yang bisa saja mengembangkan benih gigi pengganti (Gambar 7C,F ). Pada 18 dpf, potongan frontal serial menunjukkan benih gigi pengganti berkembang di sisi lingual gigi anterior. Namun, lingual ke benih gigi pengganti, tampaknya ada beberapa gigi lagi yang hadir, seperti yang ditunjukkan pada irisan sagital (Gambar 7H,N ). Dibandingkan dengan gigi luar, gigi tambahan ini lebih condong ke lingual, yang menunjukkan bahwa ada dua baris gigi sementara. Pada 24 dpf, perkembangan gigi menjadi lebih kompleks. Pada irisan melintang, banyak cincin dentin yang termineralisasi tetapi tersusun tidak teratur hadir (Gambar 7M,P ). Secara keseluruhan, selama perkembangan gigi primer pada ikan permukaan larva, lamina gigi kontinu yang khas tidak ditemukan, yang menunjukkan bahwa gigi generasi pertama dapat berkembang langsung dari epitel oral.
3,5 Sox2 Diekspresikan di Pulau Epitel pada Perkembangan Gigi Awal pada Tetra Meksiko
Imunohistokimia dilakukan pada irisan melintang mandibula tetra Meksiko dari 9 hingga 30 dpf. Data morfologi kami tidak mendukung perbedaan yang jelas dalam perkembangan benih gigi antara ikan gua Pachón dan ikan permukaan (Gambar 8 ). Pada ikan gua Pachón dan ikan permukaan, ekspresi Sox2 menandai struktur perkembangan benih gigi dalam epitel oral. Pada 9 dpf, ekspresi Sox2 diamati pada dentikel yang sedikit termineralisasi (Gambar 8F ). Pada 21 dpf, gigi fungsional labial dikelilingi oleh epitel Sox2-positif (Gambar 8I,J ). Epitel Sox2-positif meluas ke sisi lingual dari benih gigi pengganti yang sedang berkembang, membentuk ‘pulau epitel’, yang bisa menjadi lamina gigi suksesi yang sedang berkembang. Namun, beberapa pulau epitel meluas ke distal, yang menunjukkan bahwa gigi dari gigi yang sama dikelilingi oleh epitel yang mengekspresikan Sox2 yang sama. Pulau-pulau epitel ini tidak dianggap sebagai lamina gigi yang berkelanjutan. Singkatnya, selama perkembangan gigi awal pada tetra Meksiko, epitel Sox2-positif menghubungkan benih gigi dari generasi gigi yang sama. Hal ini juga menandai perkembangan benih gigi pengganti. Namun, tidak ada perbedaan morfologi yang signifikan dalam struktur perkembangan yang telah dikonfirmasi antara ikan permukaan dan ikan gua Pachón.
4 Diskusi
Laporan awal tentang proses perkembangan gigi pada larva tetra Meksiko didasarkan pada pengamatan langsung dengan mikroskop stereo, yang mengungkapkan beberapa informasi mendasar dan luas (Trapani et al. 2005 ). Misalnya, karakteristik gigi pertama relatif kekal, terutama terdiri dari gigi unikuspid berbentuk kerucut. Gigi pertama ini terutama berkembang sebelum 30 dpf, dan dengan penggantian gigi beberapa generasi, gigi unikuspid rostral secara bertahap beralih ke gigi multikuspid (Trapani et al. 2005 ). Gambar stereoskopik tetra Meksiko dewasa juga telah dipublikasikan, yang memberikan gambaran rinci tentang gigi tetra Meksiko (Garita-Alvarado et al. 2018 ). Ada juga beberapa laporan yang membahas perbedaan jumlah gigi antara dua subbentuk tetra Meksiko (Atukorala dan Franz-Odendaal 2014 ). Informasi ini penting untuk pemahaman luas tentang perkembangan dan penggantian gigi tetra Meksiko. Akan tetapi, deskripsi histologis masih belum memadai, sehingga menyoroti perlunya studi perkembangan gigi yang lebih rinci dan mendalam.
Bahasa Indonesia: Dalam perkembangan gigi, pola yang dikenal sebagai lamina gigi berkelanjutan telah diusulkan pada musang dan mamalia lainnya (Juuri dan Balic 2017 ). Dalam pola ini, benih gigi berfungsi sebagai inisiator, yang berarti bahwa ia tidak hanya membentuk gigi yang seharusnya tumbuh tetapi juga menginduksi pembentukan gigi lain dari kelas yang sama. Misalnya, M1 dianggap berfungsi sebagai inisiator yang menginduksi pembentukan semua molar di kuadrannya dalam gigi yang sama. Kami meringkas pola perkembangan ini sebagai tipe ‘arah kedua’ dalam sistem pengaturan jumlah gigi yang telah diusulkan dalam tinjauan kami yang diterbitkan sebelumnya (Fang dan Atukorallaya 2023 ). Mengenai penggantian gigi, lamina gigi suksesi telah dijelaskan dengan baik dalam model hewan lainnya (Kim et al. 2020 ; Olley et al. 2014 ; Huysseune 2004 ). Dalam proyek ini, kami bertujuan untuk menyelidiki perkembangan dan penggantian gigi pada tetra Meksiko dari perspektif histologis, dan kami juga berusaha untuk mengonfirmasi apakah lamina gigi kontinu ada pada tetra Meksiko.
Hasil kami saat ini tidak mendukung keberadaan lamina gigi kontinu selama perkembangan gigi pertama di tetra Meksiko. Dalam potongan histologis serial, kami tidak mengamati benih gigi apa pun pada tahap tutup ketika benih gigi inisiator seharusnya membentuk lamina gigi kontinu. SOX2 telah diidentifikasi sebagai penanda odontogenik pada model hewan termasuk tikus, musang, tokek, dan sebagainya (Juuri et al. 2013 ). Meskipun kami mengamati pulau epitel yang mengekspresikan Sox2 yang tampaknya menghubungkan benih gigi yang berdekatan, kemungkinan dalam gigi yang sama, morfologinya berbeda dari lamina gigi kontinu yang dilaporkan mengalami invaginasi dan berkembang secara distal dalam mesenkim mulut. Mengingat bahwa perkembangan gigi adalah proses yang dinamis, potongan dari titik waktu yang lebih rapat mungkin diperlukan untuk menangkap proses ini dengan lebih baik. Mengenai penggantian gigi, hasil kami memberikan deskripsi terperinci tentang lokalisasi dan tampilan lamina gigi suksesi di tetra Meksiko. Dimulai dari epitel email luar gigi fungsional, lamina Sox2-positif berinvaginasi ke dalam mesenkim mulut dan membentuk gigi pengganti yang sedang berkembang.
Yang menjadikan tetra Meksiko salah satu model hewan yang paling menarik adalah keberagaman sifat di antara subforma interfertilnya. Selama beberapa dekade terakhir, fokus penelitian telah bergeser dari ikan permukaan ke berbagai subforma (Atukorala et al. 2013 ; Trapani et al. 2005 ; Atukorala dan Franz-Odendaal 2018 ). Dilaporkan bahwa hibrida F1 yang dihasilkan dari persilangan antara ikan gua dan ikan permukaan memiliki sifat fenotipik perantara antara induknya, termasuk jumlah gigi (Atukorala et al. 2013 ). Penelitian ini menyelidiki faktor perkembangan embriologis yang dapat berkontribusi terhadap perbedaan jumlah gigi antara subtipe tetra Meksiko. Sayangnya, tidak ada perbedaan perkembangan penting yang diamati pada gigi larva tetra Meksiko. Kehadiran lamina gigi terus-menerus tidak dapat menjelaskan variasi jumlah gigi pada tetra Meksiko, karena tidak dikonfirmasi dalam penelitian kami. Pada gigi tetra Meksiko dewasa, irisan melintang serial mengungkapkan bahwa ikan gua Pachón memiliki lebih banyak gigi pengganti intraoseus (7,89) dan porsi gigi pengganti intraoseus yang lebih besar (86,7%) dibandingkan dengan ikan permukaan. Perbedaan jenis gigi pengganti dapat berkontribusi pada perbedaan jumlah gigi antara ikan permukaan dan ikan gua Pachón; namun, penyelidikan lebih lanjut diperlukan. Selain itu, meskipun ada laporan yang menampilkan asimetri banyak fitur pada tetra Meksiko, seperti tengkorak dewasa dan lokalisasi sel neuromast, tidak ada bukti kuat yang menunjukkan bahwa gigi tidak sejajar secara simetris di mandibula (Atukorala et al. 2019 ). Oleh karena itu, asimetri tidak dipertimbangkan saat mengambil sampel individu.
Singkatnya, penelitian ini difokuskan pada perkembangan gigi awal dan penggantian gigi pada tetra Meksiko dari perspektif histologis. Temuan kami saat ini menunjukkan bahwa gigi generasi pertama tidak berkembang sesuai dengan pola lamina gigi berkelanjutan pada tetra Meksiko, tetapi gigi digantikan oleh gigi yang dibentuk oleh lamina gigi suksesi. Hasil tersebut juga mengonfirmasi bahwa ekspresi Sox2 berfungsi sebagai penanda yang andal untuk lamina gigi suksesi dan struktur lain yang terkait dengan perkembangan gigi pada tetra Meksiko. Namun, masih ada beberapa area yang memerlukan penelitian lebih lanjut, termasuk pulau epitel positif Sox2 yang diidentifikasi dalam penelitian ini dan susunan gigi yang tidak teratur pada gigi primer pada tetra Meksiko. Yang terpenting, mekanisme yang mendasari variasi jumlah gigi masih belum diketahui.
